Санҷиши кори праймерҳо ва зондҳо дар марҳилаи аввали реагентҳои ПТР ва муайян кардани шароити мувофиқтарини реаксия шартҳои зарурии таъмини пешрафти мунтазами таҷрибаҳои расмӣ мебошанд.
Пас, чӣ гуна мо бояд санҷиши ибтидоиро дар марҳилаи аввал тасдиқ кунем?
Нишондиҳандаҳои асосӣ хатти ибтидоӣ, каҷи пурқувват, арзиши ct, самаранокии пурқувват, муайянкунии консентратсияи пасти намуна, CV ва ғайра мебошанд.
Асосӣ
Хатти асосӣ хати уфуқӣ дар каҷи тақвияти PCR мебошад.Дар чанд давраҳои аввали реаксияи пурқувваткунии ПЗР сигнали флуоресцентӣ чандон тағир намеёбад ва хати ростро ташкил медиҳад.Ин хати рост хатти асосист.
Ҳангоми скрининги зондҳои праймери PCR, диққат диҳед, ки оё сатҳи асосӣ дар сатҳи аст.Тозагии консентратсияи зондҳои ибтидоӣ ба сатҳи асосӣ таъсир мерасонад, масалан, боиси боло рафтан ё паст шудани сатҳи асосӣ мегардад.Сатҳи асосӣ низ як нишондиҳандаи хеле беихтиёрона аст.
Каҷи амплификация
Нишондиҳандаи дигари интуитивӣ шакли хатти пурқувват аст.Беҳтар аст, ки хатти S-шакл дошта бошед, то аз тақвияти дуюмдараҷа ё дигар каҷҳои ғайримуқаррарии пурқувват канорагирӣ кунед.
Арзиши Ct
Шумораи давраҳое, ки ба нуқтаи гардиш аз хати асосӣ то афзоиши экспоненсиалӣ мувофиқанд, арзиши Ct мебошад.
Барои як намуна, зондҳои гуногуни праймер боиси каҷҳои гуногуни пурқувватшавӣ оварда мешаванд ва ба арзиши мувофиқи Ct аз самаранокии тақвият ва дараҷаи дахолат таъсир мерасонад.Дар назария, арзиши Ct аз зондҳои ибтидоӣ, ки мо интихоб мекунем, ҳамон қадар беҳтар аст.
Самаранокии амплификация
Яке аз усулҳои боэътимод ва устувори арзёбии самаранокии тақвияти PCR каҷи стандартӣ мебошад, ки аз ҷониби муҳаққиқон низ ба таври васеъ эътироф шудааст.Ин усул як қатор намунаҳоро барои назорат кардани шумораи нисбии қолабҳои мақсаднок дар бар мегирад.Ин намунаҳо одатан аз ҷониби маҳлулҳои консентратсионии омехтаи пайдарпай тайёр карда мешаванд, маъмулан истифодашаванда 10-карата маҳлул аст.Бо истифода аз як қатор намунаҳои маҳлулшуда, бо истифода аз барномаи стандартии qPCR барои пурзӯр кардан барои ба даст овардани арзиши Cq ва дар ниҳоят аз рӯи консентратсияи ҳар як намуна ва арзиши мувофиқи Cq каҷи стандартӣ кашед, то муодилаи хаттии Cq= -klgX0+b ва самаранокии пурқувваткунӣ E=10(-1 /k)-1 ба даст оварда шавад.Ҳангоми истифодаи qPCR барои таҳлили миқдорӣ, самаранокии пурқувваткунӣ бояд дар ҳудуди 90%-110% (3,6>k>3,1) бошад.
Муайян кардани намунаҳои консентратсияи паст
Вақте ки консентратсияи намуна паст аст, суръати кашфи зондҳои гуногуни праймер гуногун аст.Мо барои такрор кардан 20 намунаи консентратсияи паст интихоб мекунем ва системаи зонд-праймер бо суръати баландтарини муайянкунӣ беҳтарин аст.
Коэффисиенти Тағйирот (CV)
10 намунаи такрориро бо зондҳои гуногуни праймер мувофиқи стандарти хатти реагент барои муайянкунии амплификацияи кислотаи нуклеинӣ муайян кардан мумкин аст.
Реактивҳои миқдорӣ:
Дақиқӣ
Дақиқӣ дар як гурӯҳ бояд мувофиқат кунад: коэффисиенти тағирёбанда (CV,%) арзиши логарифмикии консентратсияи санҷиш ≤5% аст.Вақте ки консентратсияи намуна паст аст, коэффисиенти тағирёбанда (CV,%) аз логарифми консентратсияи ошкоршуда ≤10% аст.
Реактивҳои сифатӣ:
Дақиқӣ
Аниқӣ дар як партия бояд ба:
(1) Коэффисиенти тағирёбии арзиши Ct (CV,%) ≤5%
Як намуна дар баробари 10 маротиба санҷида мешавад ва натиҷаҳои санҷиш бояд мувофиқ бошанд
Вақти фиристодан: сентябр-18-2021
