PCR мустақим реаксияест, ки мустақиман бофтаҳои ҳайвонот ё набототро барои тақвият бидуни истихроҷи кислотаи нуклеин истифода мебарад.Аз бисёр ҷиҳатҳо, PCR мустақим ба монанди PCR муқаррарӣ кор мекунад

Тафовути асосӣ буфери фармоишӣ мебошад, ки дар PCR мустақим истифода мешавад, намуна метавонад мустақиман бидуни истихроҷи кислотаи нуклеинӣ ба реаксияи PCR дучор шавад, аммо барои таҳаммулпазирии ферментҳо ва мутобиқати буфере, ки дар реаксияи мустақими PCR иштирок мекунанд, талаботҳои мувофиқ мавҷуданд.

Гарчанде ки дар намунаҳои умумӣ ингибиторҳои ПТР кам ё камтар мавҷуданд, PCR мустақим метавонад то ҳол дар зери таъсири ферментҳо ва буферҳо тақвияти боэътимодро ба даст орад.Реаксияи анъанавии ПТР ҳамчун як қолаб кислотаи нуклеинҳои баландсифатро талаб мекунад, ки метавонад пешрафти беҳамтои реаксияи ПТР-ро боздорад, агар дар қолаб сафедаҳо ва дигар ифлосиҳо мавҷуд бошад.Дар айни замон PCR мустақим яке аз технологияҳои маъмултарин дар соҳаи ташхиси молекулавӣ мебошад.

01 PCR мустақим дар аввал барои ҳайвонот ва растаниҳо истифода мешуд

Аввалин татбиқи PCR мустақим дар соҳаи ҳайвонот ва наботот, аз қабили хун, бофтаҳо ва мӯйҳои каламуш, гурба, мурғ, харгӯш, гӯсфанд, гов ва ғайра, баргҳо ва тухмҳои растанӣ ва ғайра, ки барои омӯзиши генотипсозӣ, трансгенӣ, ошкоркунии плазмидҳо, таҳлили нокаутҳои генҳо, муайянкунии манбаъҳои ДНК, ташхиси намудҳо ва дигар соҳаҳо истифода мешаванд.

Ин майдонҳо дорои баъзе хусусиятҳои умумӣ мебошанд, яъне таркиби генҳои мақсаднок нисбатан зиёд ва истихроҷи кислотаи нуклеинӣ мушкил аст, аз ин рӯ PCR мустақим метавонад на танҳо вақтро сарфа кунад ва ба натиҷаҳо таъсири каме расонад, балки хароҷотро сарфа кунад.

ПТР-и мустақим, ки барои ошкор кардани патоген истифода мешавад, масъалаи солҳои охир аст, баъзе аз истеҳсолкунандагони реагентҳои PCR дар ин самт ҳангоми навоварӣ кӯшишҳои зиёд ба харҷ додаанд.Махсусан дар ин эпидемияи COVID-19, дар бозор бисёр чунин маҳсулоти муайянкунанда пайдо шуданд, ба монанди маҷмӯаи муайянкунии кислотаи нуклеинӣ SARS-CoV-2 (Усули бисёрҷонибаи PCR Fluorescent Probe), ки аз ҷониби Foregene таҳқиқ ва таҳия шудааст, ки технологияи воқеии RT PCR (rRT-PCR) барои муайян кардани сифатӣ-нафсонии кислотаи SARS-CoV-и одамро истифода мебарад. намунаҳои тампони гарингиалӣ.

Foregene яке аз ширкатҳое мебошад, ки технологияи мустақими PCR-ро барои муайян кардани муқаррарии ORF1ab, N, E вавариант насабҳои кислотаҳои нуклеинӣ дар намунаҳои тампони бинии бинӣ ё орофарингеалии инсон ба монанди SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage (UK), B.1.351 lineage (ZA), B.1.617 lineage (IND) ва P.1 lineage (BR).

02  Реактивҳое, ки барои PCR мустақим лозиманд

Намунаи Lysate

Лизати намунавӣ метавонад аз ҷониби худ танзим карда шавад ё харида шавад.Тафовут дар таркиби тамғаҳои гуногуни лизат қобилияти лизингиро фарқ мекунад ва он гоҳ вақти лизат каме фарқ мекунад.Масалан, барои тайёр кардани намунаҳои бофтаи ҳайвонот, одатан 30 дақиқа ё шабонарӯзӣ тавсия дода мешавад ва маҳлули лизис барои вирусҳо аз 3-10 дақиқа иборат аст.

омехтаи Master PCR

Тавсия дода мешавад, ки полимеразаи гарми ДНК барои баланд бардоштани амплификацияи мушаххас ва баланд бардоштани қобилияти амплификация истифода шавад.Асоси PCR мустақим полимерази хеле таҳаммулпазир аст.

Компонентҳоро дар намуна, ки ба амплификацияи ДНК таъсир мерасонанд, нест кунед ё манъ кунед

Пас аз коркарди намуна бо лизат, сафедаҳо, липидҳо ва дигар партовҳои ҳуҷайра озод карда мешаванд, ин моддаҳо реаксияи PCR-ро бозмедоранд.Аз ин рӯ, ПЗР мустақиман илова кардани бартарафкунии мувофиқ ё ингибиторҳоро барои кам кардани таъсири ин омилҳо талаб мекунад.

03  Маҷмӯаи панҷ нуқтаи дониши мустақими PCR

Аввалан, технологияи мустақими PCR технологияи мустақими PCR барои намунаҳои гуногуни биологӣ мебошад.Дар ин ҳолати техникӣ, барои ҷудо кардан ва истихроҷи кислотаи нуклеин, бевосита истифода бурдани намунаи матоъ ба сифати объект ва илова кардани праймерҳои генҳои мақсаднок барои иҷрои реаксияи PCR лозим нест.

Дуюм, технологияи мустақими PCR на танҳо технологияи анъанавии амплификацияи қолаби ДНК аст, балки инчунин дар бар мегирад, ки қолаби РНК транскрипсияи баръакси PCR.

Сеюм, технологияи мустақими PCR на танҳо реаксияҳои муқаррарии сифатии ПТР-ро дар намунаҳои бофта иҷро мекунад, балки реаксияҳои реаксияҳои qPCR-ро дар вақти воқеӣ низ дар бар мегирад, ки системаи реаксия дорои қобилияти қавии флуорессенсияи зидди замина ва хомӯш кардани флуорессенсияи эндогенӣ қобилияти антагонистиро талаб мекунад.

Чорум, намунаҳое, ки бо технологияи мустақими PCR ҳадаф гирифта шудаанд, танҳо ба баровардани қолибҳои кислотаи нуклеин ниёз доранд ва сафедаҳо, полисахаридҳо, ионҳои намак ва ғайраҳоро, ки ба реаксияи PCR халал мерасонанд, хориҷ намекунанд.Ин талаб мекунад, ки полимерази кислотаи нуклеинӣ ва PCR Mix дар системаи реаксия муқовимат ва мутобиқшавии аъло дошта бошанд, то фаъолияти ферментҳо ва дақиқии такрориро дар шароити мураккаб таъмин кунанд.

Панҷум, намунаи матоъе, ки бо технологияи мустақими PCR бе ягон табобати ғанисозии кислотаи нуклеинӣ ҳадаф гирифта шудааст ва миқдори қолаб хеле хурд аст, ки системаи реаксия ҳассосияти бениҳоят баланд ва самаранокии пурқувватро талаб мекунад.