Технологияи ташхиси молекулавӣ усулҳои биологияи молекулавӣ барои муайян кардани ифода ва сохтори маводи генетикии бадани инсон ва патогенҳои гуногунро истифода мебарад, то ба ҳадафи пешгӯӣ ва ташхиси бемориҳо ноил шавад.

Дар солҳои охир, бо такмил ва такрори технологияи ташхиси молекулавӣ, татбиқи клиникии ташхиси молекулавӣ торафт васеътар ва амиқтар шуд ва бозори ташхиси молекулавӣ ба давраи рушди босуръат ворид шуд.

Муаллиф технологияҳои маъмули ташхиси молекулавиро дар бозор ҷамъбаст намуда, ба се қисм тақсим шудааст: дар қисми аввал технологияи ПТР, дар қисми дуюм технологияи изотермикии кислотаи нуклеинӣ ва дар қисми дуюм технологияи пайдарпайӣ муаррифӣ карда мешавад.

01

Қисми I: Технологияи PCR

Технологияи PCR

PCR (реаксияи занҷири полимеразӣ) яке аз технологияҳои амплификацияи ДНК дар vitro буда, таърихи зиёда аз 30 сол дорад.

Технологияи PCR дар соли 1983 аз ҷониби Кари Муллис аз Сетуси ИМА пешрав шуда буд.Муллис барои патенти PCR дар соли 1985 муроҷиат кард ва дар ҳамон сол аввалин мақолаи академии PCR-ро оид ба илм нашр кард.Муллис дар соли 1993 барандаи ҷоизаи Нобел дар бахши кимиё шуд.

Принсипҳои асосии PCR

PCR метавонад порчаҳои ДНК-и мақсаднокро беш аз як миллион маротиба афзоиш диҳад.Принсип ин аст, ки дар зери катализи полимеразаи ДНК, риштаи волидайн ДНК ҳамчун қолаб истифода мешавад ва як праймери мушаххас ҳамчун нуқтаи ибтидоӣ барои васеъшавӣ истифода мешавад.Он дар in vitro тавассути қадамҳо ба монанди денатуратсия, тозакунӣ ва васеъшавӣ такрор карда мешавад.Раванди ДНК-и риштаи духтар ба ДНК-и қолаби риштаи волидайн мукаммал аст.

Раванди стандартии PCR ба се марҳила тақсим мешавад:

1. Денатуратсия: Ҳарорати баландро барои ҷудо кардани риштаҳои дукаратаи ДНК истифода баред.Пайвастҳои гидрогении байни риштаҳои дугонаи ДНК дар ҳарорати баланд (93-98°С) канда мешаванд.

2. Табобат: Пас аз ҷудо шудани ДНК-и дуқабата, ҳарорат паст карда мешавад, то праймер ба ДНК-и якқатор пайваст шавад.

3. Васеъ: Полимеразаи ДНК ба синтез кардани риштаҳои комплементарӣ дар баробари риштаҳои ДНК аз праймерҳои пайвастшуда ҳангоми паст шудани ҳарорат оғоз мекунад.Вақте ки тамдид ба итмом мерасад, давра ба итмом мерасад ва шумораи порчаҳои ДНК дучанд мешавад.

Ин се марҳиларо 25-35 маротиба такрор кунед, шумораи пораҳои ДНК ба таври экспоненсиалӣ зиёд мешавад.

Ихтироъкории PCR дар он аст, ки праймерҳои гуногун метавонанд барои генҳои гуногуни мақсаднок тарҳрезӣ шаванд, то пораҳои генҳои мақсаднок дар як муддати кӯтоҳ тақвият дода шаванд.

То ба ҳол, ПЗР-ро ба се категория тақсим кардан мумкин аст, яъне ПЗР оддӣ, ПЗР-и миқдорӣ флуоресцентӣ ва ПЗР рақамӣ.

Насли якуми PCR оддӣ

Барои пурзӯр кардани гени мақсаднок асбоби оддии пурқувваткунии ПТР-ро истифода баред ва сипас электрофорези гели агарозро барои муайян кардани маҳсулот истифода баред, танҳо таҳлили сифатӣ мумкин аст.

Камбудиҳои асосии насли якуми PCR:

-Моил ба тақвияти ғайримуқаррарӣ ва натиҷаҳои мусбати бардурӯғ.

-Муайян кардан вақти зиёдро мегирад ва амалиёт душвор аст.

-Танҳо санҷиши сифатӣ гузаронида мешавад.

Насли дуюми флуорессенси PCR миқдорӣ

PCR-и миқдории флуоресцентӣ (PCR-и воқеӣ), ки бо номи qPCR низ маълум аст, барои назорат кардани ҷамъшавии маҳсулоти пурқувват тавассути ҷамъоварии сигналҳои флуоресцентӣ тавассути илова кардани зондҳои флуоресцентӣ, ки метавонанд пешрафти системаи реаксияро нишон диҳанд ва натиҷаҳоро ба воситаи каҷи флуоресцентҳо баҳогузорӣ кунанд ва он метавонад бо арзиши миқдори CQ муайян карда шавад.

Азбаски технологияи qPCR дар системаи пӯшида амалӣ карда мешавад, эҳтимолияти ифлосшавӣ коҳиш меёбад ва сигнали флуоресцентиро барои муайянкунии миқдорӣ назорат кардан мумкин аст, аз ин рӯ он дар амалияи клиникӣ васеъ истифода мешавад ва ба технологияи бартаридошта дар PCR табдил ёфтааст.

Моддаҳои флуоресцентие, ки дар PCR-и миқдории флуоресценти воқеӣ истифода мешаванд, метавон ба инҳо тақсим кард: зондҳои флуоресцентии TaqMan, маякҳои молекулавӣ ва рангҳои флуоресцентӣ.

1) Зондҳои флуоресцентии TaqMan:

Ҳангоми амплификацияи ПЗР, ҳангоми илова кардани як ҷуфт праймерҳо як зондҳои махсуси флюоресцентӣ илова карда мешаванд.Зонд олигонуклеотид аст ва ду нӯги он мутаносибан бо гурӯҳи флуорессенти хабарнигор ва гурӯҳи флуоресценти хомӯшкунанда нишон дода шудааст.

Вақте ки зонд солим аст, сигнали флуоресценти аз ҷониби гурӯҳи хабарнигорон баровардашуда аз ҷониби гурӯҳи хомӯшкунӣ ҷаббида мешавад;ҳангоми амплификацияи ПТР, фаъолияти 5′-3′ экзонуклеазаи ферменти Taq зондро мешиканад ва таназзул мекунад ва гурӯҳи флуоресцентии гузоришдиҳанда ва хомӯшкунандаро месозад. Гурӯҳи флуоресцентӣ ҷудо карда мешавад, то системаи назорати флуоресцент метавонад сигнали флуорессенсияро қабул кунад, яъне ҳар дафъае, ки риштаи ДНК пурзӯр мешавад, грипп ва грипп ба вуҷуд меояд, сигнал бо ташаккули маҳсулоти PCR комилан ҳамоҳанг карда мешавад.

2) Рангҳои флуоресцентии SYBR:

Дар системаи реаксияи PCR зиёда аз ранги флюоресцентии SYBR илова карда мешавад.Пас аз он ки рангҳои флуоресцентии SYBR ба таври мушаххас ба риштаи дукаратаи ДНК дохил карда мешаванд, он сигнали флуоресцентӣ мебарорад.Молекулаи рангҳои SYBR, ки ба занҷир дохил карда нашудааст, ягон сигнали флуоресцентӣ намебарорад ва ба ин васила сигнали флуоресцентиро таъмин мекунад Афзоиши маҳсулоти PCR бо афзоиши маҳсулоти PCR комилан ҳамоҳанг карда мешавад.SYBR танҳо ба ДНК-и дуқабата мепайвандад, аз ин рӯ хати гудохта метавонад барои муайян кардани мушаххас будани реаксияи PCR истифода шавад.

3) Маякҳои молекулавӣ

Ин зондҳои олигонуклеотидҳои дукарата бо тамғаи поя, ки дар нӯги 5 ва 3 сохтори мӯи тақрибан 8 пояро ташкил медиҳад.Пайдарпайии кислотаи нуклеинӣ дар ҳарду канори онҳо ба таври иловагӣ ҷуфт карда мешаванд, ки гурӯҳи флуоресцентӣ ва гурӯҳи хомӯшкунандаро сахт мекунанд.Пӯшед, он флуоресцентро тавлид намекунад.

Пас аз тавлиди маҳсулоти PCR, дар ҷараёни коркард, қисми миёнаи маяки молекулавӣ бо пайдарпаии мушаххаси ДНК ҷуфт карда мешавад ва гени флуоресцентӣ аз гени хомӯшкунанда ҷудо карда мешавад, то флуорессенсияро тавлид кунад.

Камбудиҳои асосии насли дуюми PCR:

Ҳассосият ҳанӯз нокифоя аст ва ошкор кардани намунаҳои нусхабардорӣ дақиқ нест.

Таъсири арзиши замина вуҷуд дорад ва натиҷа ба дахолат ҳассос аст.

Насли сеюми PCR рақамӣ

PCR рақамӣ (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) рақами нусхаи пайдарпайии ҳадафро тавассути муайянкунии нуқтаи ниҳоӣ ҳисоб мекунад ва метавонад бидуни истифодаи назорати дохилӣ ва каҷҳои стандартӣ муайянкунии дақиқи мутлақи миқдорӣ анҷом диҳад.

ПТР-и рақамӣ муайянкунии нуқтаи ниҳоиро истифода мебарад ва аз арзиши Ct (ҳадди давра) вобаста нест, аз ин рӯ ба реаксияи PCR рақамӣ аз самаранокии амплификация камтар таъсир мерасонад ва таҳаммулпазирӣ ба ингибиторҳои реаксияи ПТР бо дақиқии баланд ва такроршавандагӣ беҳтар мешавад.

Аз сабаби хусусиятҳои ҳассосияти баланд ва дақиқии баланд, он аз ҷониби ингибиторҳои реаксияи PCR ба осонӣ халал намерасонад ва он метавонад бидуни маҳсулоти стандартӣ, ки ба нуқтаи доғи тадқиқот ва татбиқ табдил ёфтааст, ба миқдори воқеии мутлақ ноил шавад.

Аз рӯи шаклҳои гуногуни воҳиди реаксия онро ба се намуд тақсим кардан мумкин аст: системаҳои микрофлюидӣ, чипӣ ва қатраӣ.