1. Қабули маҳлули РНК-ро муайян кунед
Абсорбсия дар 280, 320, 230 ва 260 нм мутаносибан қиматҳои кислотаи нуклеинӣ, замина (гуруд будани маҳлул), консентратсияи намак ва моддаҳои органикӣ ба монанди сафедаро ифода мекунад.Умуман, танҳо ба OD260/OD280 нигоҳ кунед (Ratio, R).Вақте ки 1,8 ~ 2,0, мо фикр мекунем, ки ифлосшавии сафеда ё дигар моддаҳои органикиро дар РНК таҳаммул кардан мумкин аст, аммо бояд қайд кард, ки вақте ки Трис ҳамчун буфер барои муайян кардани абсорбент истифода мешавад, арзиши R метавонад аз 2 зиёдтар бошад (умуман он бояд <2,2 бошад).Дар вакти R<1,8 ифлосшавии сафеда ё дигар моддахои органики дар махлул бештар аён мегардад ва такдири РНК-ро аз руи эхтиёчот муайян кардан мумкин аст.Вақте ки R>2.2, ин маънои онро дорад, ки РНК ба як кислотаи нуклеинӣ гидролиз шудааст.
2. Намунаи электрофорезии РНК
Умуман, гели денатуринг барои электрофорези РНК истифода мешавад, аммо агар он танҳо барои муайян кардани сифати РНК бошад, гели денатуризатсия шарт нест ва гели оддии агарозиро метавон истифода бурд.Мақсади электрофорез муайян кардани якпорчагии бандҳои 28S ва 18S ва таносуби онҳо, ё якпорчагии масхҳои mRNA мебошад.Умуман, агар бандҳои 28S ва 18S равшан, равшан ва тез бошанд (дар канори бандҳо равшан аст) ва равшании 28S аз бандҳои 18S ду маротиба зиёдтар бошад, мо сифати РНК-ро хуб мешуморем.
Дар боло ду усуле ҳастанд, ки мо одатан истифода мебарем, аммо ҳеҷ яке аз ин ду усул ба мо возеҳ гуфта наметавонанд, ки оё дар маҳлули РНК боқимонда RNase вуҷуд дорад.Агар дар махлул микдори хеле ками РНаз мавчуд бошад, онро бо усули дар боло зикршуда ошкор кардан барои мо душвор аст, аммо аксари реаксияхои минбаъдаи ферментативи дар ҳарорати аз 37 дараҷа боло ва муддати тӯлонӣ сурат мегиранд.Ба ин тартиб агар дар маҳлули РНК миқдори хеле ками RNase мавҷуд бошад, он гоҳ барои иҷрои нақши онҳо дар таҷрибаҳои минбаъда муҳити хеле мувофиқ ва вақти хеле мувофиқ пайдо мешавад ва албатта таҷриба дар ин вақт сард хоҳад буд.Дар зер мо усулеро пешниҳод мекунем, ки метавонад дар маҳлули РНК мавҷуд будани RNase боқимондаро тасдиқ кунад.
3. Санҷиши нигоҳдории гармӣ
Мувофиқи консентратсияи намуна, аз маҳлули РНК ду РНК-и 1000 нг кашида, онро ба найчаи центрифугаи 0,5 мл илова кунед ва онро бо буфери рН 7,0 Трис ба ҳаҷми умумии 10 ул илова кунед ва сипас сарпӯши найчаро маҳкам кунед.Яке аз онҳоро ба ваннаи обии ҳарорати доимии 70°С гузошта, 1 соат гарм нигоҳ доред.Қисми дигар дар яхдон барои 1 соат нигоҳ дошта мешавад -20 ° C.Вақте ки вақт тамом мешавад, ду намунаро барои электрофорез хориҷ кунед.Пас аз анҷоми электрофорез, бандҳои электрофорезии ҳардуро муқоиса кунед.Агар бандҳои ҳарду мувофиқ бошанд ё фарқияти назаррас надошта бошанд (албатта, бандҳои онҳо низ ба шартҳои усули 2 ҷавобгӯ бошанд), ин маънои онро дорад, ки дар маҳлули РНК олудашавии боқимондаи RNase вуҷуд надорад ва сифати РНК хеле хуб аст.Баръакс, агар намунае, ки дар 70 ° C инкуб карда шудааст, таназзули аёнро нишон диҳад, ин нишон медиҳад, ки дар маҳлули РНК ифлосшавии RNase мавҷуд аст.
2 Усулҳо ва усулҳои таҷрибавӣ барои истихроҷи РНК
Мушкилоте, ки мо аксар вақт ҳангоми истихроҷи РНК дучор мешавем, инҳоянд: (1) ҳосили РНК паст аст;(2) РНК ифлосшавии ҷиддии намак дорад;(3) РНК дорои ифлосшавии ҷиддии ҳалкунандаҳои органикӣ;(4) таназзули намуна ва мушкилоти дигар
1. Реагентҳои умумии истихроҷи РНК, ки маъмулан истифода мешаванд
Усули изоотиоцианати гуанидин ва усули Тризол усулҳои маъмултарини истихроҷи РНК аз бофтаҳои ҳайвонот ва ҳуҷайраҳои ҳайвонот мебошанд.Он махсусан барои намунаҳо ва бофтаҳои хурд, ки истихроҷи онҳо махсусан душвор аст, ба монанди истихроҷи умумии РНК аз пӯсти харгӯш ва бофтаи пайвасткунандаи ҳайвонот мувофиқ аст;гайр аз ин, Тризолро хамчун реагенти лизизии таъиноти умумй барои истихрочи бофтахои растанй, бактерияхо, занбуругхо ва дигар бофтахо низ истифода бурдан мумкин аст.Барои бофтаҳои растании дорои полисахаридҳо ва полифенолҳо, аз қабили олейфераи камелия, барги чой, рапс ва ғайра, усули CTAB барои истихроҷи умумии РНК низ истифода мешавад.
Ҳамчун як усули анъанавӣ, усули дукаратаи сутун низ аз сабаби кори муқаррарии ҳарорати худ, зарурати илова кардани RNase ва бехатарӣ - бе хлороформ, фенолҳо ва дигар реагентҳои органикӣ барои истихроҷ хеле маъмул аст.(маҳсулоти тавсияшуда )
2. Истихроҷи умумии РНК аз бофтаҳои ҳайвонот
(1) Кӯшиш кунед, ки бофтаи тару тоза интихоб кунед, агар он тару тоза набошад (бењтараш дар давоми се моҳ - 80 ℃ яхдон ё дар нитрогени моеъ яхкардашуда. Ҳангоми буридани матоъ бевосита дар ҳарорати хонагӣ набуред, ҳатман онро ба қуттии ях гузоред, кӯшиш кунед, ки такроран яхкунӣ ва обшавиро пешгирӣ кунед.
(2) Барои буридани як пораи хурди матоъ аз кайчи ва пинцетҳои тоза истифода баред, ҳангоми буридани намуна кӯшиш кунед, ки қисми марказии матоъро буред ё аввал порчаи калони матоъро аз мобайн буред ва сипас намунаро дар ҳолати буридани тару тоза буред.Бофтаи хориҷшуда бояд пурра реза карда шавад, бофтаи резашударо ба найчаи EP бе RNase гузоред, лизатро илова кунед, бофтаи резашуда бояд пурра ба лизат дучор шавад ва барои гомогенизатсия омода шавад.
(3) Барои бофтаҳои муқаррарӣ, барои гомогенизатсия бофтаҳои мошро (30-60 мг) интихоб кунед.Агар бофтаҳо миқдори зиёди сафеда, равған ё бофтаҳои нахдори зичро ба мисли ҷигар дошта бошанд, миқдори бофтаҳои буридашударо ба таври мувофиқ зиёд ё кам кунед (ихтиёрӣ) 10~20 мг интихоб кунед).
(4) Агар мушакҳои моҳӣ, гӯшти майгу, медуза ва дигар бофтаҳои дорои миқдори зиёди об гирифта шаванд, ҳаҷми намуна бояд ба таври мувофиқ зиёд карда шавад (тавсияшаванда 100-200 мг).
(5) Агар шароит имкон диҳад, бофтаи ҳайвонотро пас аз гомогенизатсия бо гомогенизатори бофтаи баландгузар, агар чунин таҷҳизот мавҷуд набошад, мустақиман истихроҷ кардан мумкин аст.
(6) РНК, ки пас аз истихроҷи ниҳоӣ гирифта шудааст, бояд фавран ба қуттии ях гузошта шавад, то таназзули РНК кам карда шавад.
3. Истеҳсоли РНК-и ҳуҷайраҳои ҳайвонот
(1) Ҳуҷайраҳои суспензия: мустақиман центрифуга кунед ва муҳити атрофро партоед, бо PBS стерилӣ барои 1-2 маротиба бишӯед, сипас бо миқдори мувофиқи PBS суспензия кунед ва сипас лизатро барои лизис илова кунед.Пас аз пурра партофтани моеъ лизатро мустақиман ба ҳуҷайраҳои пошида илова накунед.Ин боиси он мегардад, ки бастаи гистоне, ки пас аз ҳуҷайраҳои лизишуда дар қабати берунӣ бароварда мешавад, ба беруни ҳуҷайраҳои таҳшиншуда часпида, ба ин васила алоқаи ҳуҷайраҳои дохили пеллетро бо лизат маҳдуд мекунад., ки боиси лизиси нопурраи ҳуҷайра ва кам шудани ҳосили РНК мегардад.
(2) Ҳуҷайраҳое, ки нимчаспаканд ё сахт часпидаанд: Пас аз партофтани муҳити атроф, бо PBS барои 1-2 маротиба шуста, сипас миқдори мувофиқи PBS-ро мустақиман ҷаббида кунед ва табақчаи фарҳангиро бо пипетка ё таппонча бод кунед, то ҳуҷайраҳоро партояд ва онҳоро ба ҳуҷайраҳои бе РНК интиқол диҳед.Барои экстракция лизатро ба найчаи EP аз фермент илова кунед.
(3) Ҳуҷайраҳои пайвастшуда: аввал бояд бо трипсин ҳазм карда шаванд, сипас дар қубурҳои РН-и бе RNase ҷамъ карда шаванд, барои хориҷ кардани супернатант центрифуга карда шаванд, 1-2 маротиба бо PBS шуста, барои тоза кардани трипсинҳои зиёдатӣ ва бо миқдори мувофиқи PBS дубора боздошта шаванд. Сипас ба марҳилаи истихроҷ гузаред.
4. Истеҳсоли РНК-и растанӣ
Бофтаҳои растанӣ аз пайвастагиҳои фенолӣ бой мебошанд ё аз полисахаридҳо бой мебошанд ё дорои баъзе метаболитҳои дуюмдараҷаи номаълум ё дорои фаъолияти баланди RNase мебошанд.Ин моддаҳо пас аз лизиси ҳуҷайра бо РНК зич пайваст шуда, комплексҳои ҳалнашаванда ё преципитатҳои коллоидиро ба вуҷуд меоранд, ки хориҷ кардан душвор аст.Бинобар ин, вақте ки мо бофтаи растанӣ истихроҷ мекунем, мо бояд маҷмӯаро барои растаниҳо интихоб кунем.Лизати маҷмӯа метавонад масъалаҳои оксидшавии осони полифенолҳо ва ҷудошавии пайвастагиҳои полисахаридҳо ва кислотаҳои нуклеинро самаранок ҳал кунад.
(Барои истихроҷи РНК полисахариди полифенол, маҳсулоти тавсияшаванда:
(1) Пӯст, селлюлоза, тухмҳо, баргҳо ва ғайраҳои растанӣ бояд дар як маҳлул пурра хок карда шаванд.Дар ҷараёни суфтакунӣ, нитрогени моеъ бояд сари вақт пур карда шавад, то ки намуна гудохта нашавад.Намунаи замин бояд зуд ба лизат илова карда шавад ва ларзон карда шавад, то таназзули РНК пешгирӣ карда шавад.
(2) Барои намунаҳои аз нахи бой ба монанди баргҳои биринҷ ва гандум, миқдори истихроҷ бояд ба таври мувофиқ кам карда шавад, вагарна суфтакунӣ ва лизиси матоъ пурра нахоҳад буд, ки дар натиҷа ҳосили пасти РНК истихроҷ карда мешавад.
(3) Барои бофтаҳои растании дорои миқдори зиёди об, ба монанди меваи анор, меваи тарбуз, меваи шафтолу ва ғайра, андозаи намуна бояд ба таври мувофиқ зиёд карда шавад (100-200 мг ихтиёрӣ аст).
(4) Бофтаҳои растанӣ, аз қабили баргҳои растанӣ, ризомаҳо, меваҳои сахт ва дигар маводҳо одатан тавсия дода мешавад, ки нитрогени моеъро барои бодиққат омехта кардани компонентҳо дар миномет истифода баранд ва сипас ба марҳилаи истихроҷ гузаред.Гомогенизаторҳои анъанавии бофтаҳо метавонанд дар гомогенизатсияи бофтаҳои растанӣ самаранок набошанд ва умуман тавсия дода намешаванд.
5. Чораҳои эҳтиётӣ барои истихроҷи РНК
(1) Намунаҳои матоъ бояд то ҳадди имкон тару тоза бошанд, то аз яхкунӣ ва обшавии такрорӣ пешгирӣ карда шаванд.
(2) Ҳангоми истихроҷ матоъ бояд пурра хок карда шавад ва миқдори матоъ набояд хеле кам бошад, бигзор аз ҳад зиёд бошад.
(3) Пас аз илова кардани лизат барои пурра лиза кардани намуна вақти кофӣ барои инкубатсия дода мешавад.
(4) Ҳангоми истифодаи усули Тризол барои истихроҷ, принсипи азхудкунии супернатант пас аз стратификация "бартарӣ додан ба нафаскашӣ камтар аз нафаскашӣ" аст ва набояд ба қабати миёна истихроҷ кунад, вагарна он боиси олудашавии ҷиддии геномии ДНК мегардад.
(5) Ҳангоми шустан, моеъи шустушӯй бояд дар атрофи девори қубур пурра ворид шавад, то шустани ҳаматарафаро таъмин кунад.
(6) Барои усули истихроҷи сутун, ба ғайр аз ҷудо кардани сутун пас аз шустан, сутуни адсорбсия низ бояд дар як курсии ултра тоза ҷойгир карда шавад ва барои 5-10 дақиқа дамида шавад, то ҳалкунандаи органикӣ то хушкӣ пурра бухор шавад.
(7) Дар охирин элюсияи усули сутун, пас аз илова кардани оби DEPC, он бояд барои 3-5 дақиқа инкубатсия карда шавад ё оби DEPC бояд пешакӣ то 60 ° C гарм карда шавад, то ҳосили элюатсияро зиёд кунад.Дар усули анъанавии ҷудошавии Тризол ва боришоти изопропанол, РНК ниҳоӣ дар оби DEPC гудохта мешавад, аз ин рӯ бояд барои обшавӣ вақти мувофиқ дода шавад ва поёни найчаи центрифуга бояд пайваста бо нӯги пипетка дамида шавад.
3 ТСабабҳо ва роҳҳои ҳалли консентратсияи пасти РНК/сифати паст
1. Ҳосил хеле паст аст
Намунаи истихроҷшуда хеле кам аст, маблағи умумӣ нокифоя аст ё намунаи истихроҷшуда аз ҳад зиёд ва лизис пурра нест;бофта ё ҳуҷайраҳои дорои сифати мувофиқ бояд барои истихроҷ истифода бурда шавад, коркарди пешакии намуна бояд хуб анҷом дода шавад ва лизис бояд кофӣ бошад.
2. Боқимондаҳои геномӣ
Хангоми бо усули Тризол истихроч кардан, хангоми ба кабати мобайнй чашиданн моддаи знёда аз болои кабат ифлосшавии чиддии геном ба амал меояд;Ҳангоми ба қабати миёна намакидан лозим аст, ки ба қабати миёна диққати бештар дода шавад.Агар усули сутун барои истихроҷ истифода шавад, маҷмӯаи дорои DNase I метавонад барои истихроҷ интихоб карда шавад.Кислотаи нуклеини дар мембрана адсорбшуда мустақиман бо DNase I ҳазм мешавад, ки метавонад боқимондаҳои ДНК-ро хеле кам кунад.
3. Деградатсияи РНК
Ин метавонад таназзули худи намунаи истихроҷшуда ё таназзул дар ҷараёни истихроҷ бошад;то ҳадди имкон намунаҳои тару тозаро барои истихроҷи РНК истифода бурдан лозим аст ва намунаҳои ҷамъоварда бояд дар нитрогени моеъ ё дар яхдон -80°С сари вақт нигоҳ дошта шаванд ва аз яхкунӣ ва обшавии такрорӣ пешгирӣ карда шавад.Маслиҳатҳои ройгони RNase/DNase, қубурҳои центрифуга ва дигар маводҳо бояд дар раванди истихроҷи РНК истифода шаванд.Раванди истихроҷ бояд ҳарчи зудтар бошад.РНК-и истихроҷшуда бояд дар қуттии ях ҷойгир карда шавад ва дар вақти -80 нигоҳ дошта шавад.Агар РНК-и истихроҷшударо тавассути электрофорези гел ошкор кардан лозим бошад, бояд фавран пас аз экстраксия электрофорез гузаронида шавад ва буфери электрофорез бояд бо буфери нав омодашуда иваз карда шавад.
4. Намак ва боқимондаҳои ҳалкунандаи органикӣ
Дар реагентҳои экстраксионӣ намакҳои фенол ва гуанидин ва дар маҳлули шустушӯй этанол мавҷуд аст.Дар рафти экстракция лизато пурра чабда нашу-да партофта мешуд, махлули шуста пурра хушк нашудааст.Намакҳои боқимонда ва ҳалкунандаҳои органикӣ барои транскрипсияи минбаъдаи баръакс ва PCR зарароваранд.Дараҷаҳои гуногуни монеъшавӣ, аз ин рӯ, лизати матоъ бояд дар ҷараёни истихроҷ пурра хориҷ карда шавад ва шустан бояд кофӣ бошад, то деворҳои гирду атрофи найча шуста шаванд.Илова бар ин, найча холӣ ва дамида як қадами зарурӣ аст, ки боқимондаи моддаҳои органикиро боз ҳам кам мекунад.
Барои маълумоти бештар дар бораи истихроҷи RNA, лутфан вебсайти моро пайгирӣ кунед:
www.foreivd.com барои маълумоти бештар.
Вақти интишор: Декабри 01-2022
