PCR технологияи васеъ истифодашавандаи амплификатсияи кислотаи нуклеинӣ мебошад ва аз сабаби ҳассосият ва хосияташ васеъ истифода мешавад.Бо вуҷуди ин, ПЗР денатуратсияи гармии такрориро талаб мекунад ва наметавонад аз маҳдудиятҳои такя ба асбобҳо ва таҷҳизот халос шавад, ки истифодаи онро дар озмоиши клиникии клиникӣ маҳдуд мекунад.

Аз ибтидои солҳои 1990-ум, бисёр лабораторияҳо ба таҳияи технологияи баланд бардоштани ҳарорати доимӣ шурӯъ карданд, ки денатуратсияи гармиро талаб намекунад.Ҳоло онҳо технологияи пурзӯркунии изотермикии ҳалқа, технологияи амплификацияи изотермиии ивазкунандаи ришта, технологияи амплификацияи изотермиии даврашакл ва вобастагии пайдарпаии кислотаи нуклеинро таҳия кардаанд.Технологияи изотермикии изотермикӣ ва дигар технологияҳо. 

Lпурзур намудани изотермикии оо-миёнагй

Принсипи амплификация ба он асос ёфтааст, ки ДНК дар ҳолати мувозинати динамикӣ дар тақрибан 65°С қарор дорад.Вақте ки ягон праймер ҷуфт карда шуда, ба қисми пурраи ДНК-и дуқабата дароз карда мешавад, риштаи дигар ҷудо мешавад ва якқатор мешавад.

Дар ин ҳарорат, ДНК 4 праймери мушаххасро истифода мебарад, то ба полимеразаи ДНК-и риштаҷойгиранда такя кунад, то синтези ДНК-и риштаҷойгиранда пайваста гардиши доимӣ кунад.

Аввалан 6 минтақаи мушаххаси F3, F2, F1, B1, B2, B3-ро дар гени ҳадаф муайян кунед ва сипас дар асоси ин 6 минтақаи мушаххас 4 праймерро тарҳрезӣ кунед (тавре ки дар расми зер нишон дода шудааст):

Примери дохилӣ (FIP) аз F1c ва F2 иборат аст.

Примери дохилии аќиб (BIP) аз B1c ва B2 иборат аст ва TTTT ҳамчун фосила дар мобайн истифода мешавад.

Примерҳои берунии F3 ва B3 мутаносибан аз минтақаҳои F3 ва B3 дар гени мавриди ҳадаф иборатанд.

Дар системаи реаксияи LAMP консентратсияи праймери ботинӣ нисбат ба праймери беруна чанд маротиба зиёд аст.Примери дарунӣ аввал бо риштаи шаблон муттаҳид карда мешавад, то риштаи иловагиро синтез кунад, то риштаи дукаратаи ДНК-ро ташкил кунад.Баъдан, праймери беруна бо риштаи шаблон якҷоя карда мешавад, то риштаи дукаратаи ДНК-ро ташкил диҳад.Дар зери таъсири полимеразаи BstDNA риштаи комплементарӣ, ки аз ҷониби праймери дохилӣ синтез шудааст, озод карда мешавад.Пас аз як қатор реаксияҳо, риштаи пурракунанда дар ниҳоят як риштаи ягонаи ДНК-ро бо сохтори гантел ташкил медиҳад.

Сохтори ягонаи ДНК-и гантел ҳамчун як қолаб барои пайваста ташаккул додани ДНК-и сохтори гузариши поя бо охири кушода истифода мешавад.Примерҳои дарунӣ ва берунӣ ДНК-и сохтори гузариши поя-халқаро роҳнамоӣ мекунанд, ки пайваста реаксияҳои ҷобаҷокунӣ ва васеъшавии риштаҳоро аз сар мегузаронанд ва дар ниҳоят сохторҳои сершумори ҳалқаҳои дарозии гуногунро ташкил медиҳанд.омехтаи ДНК.

Афзалиятҳо ва нуқсонҳои тақвияти изотермикии ҳалқавӣ

Афзалиятҳои LAMP:

(1) Самаранокии баланди амплификация, ки метавонад 1-10 нусхаи гени мақсаднокро дар давоми 1 соат самаранок афзоиш диҳад ва самаранокии амплификация 10-100 маротиба аз PCR оддӣ аст.

(2) Вақти реаксия кӯтоҳ аст, хосият қавӣ аст ва таҷҳизоти махсус талаб карда намешавад.

Камбудиҳои LAMP:

(1) Талабот ба праймерҳо махсусан баланд аст.

(2) Маҳсулоти пурқувватшударо барои клонкунӣ ва пайдарпайкунӣ истифода бурдан мумкин нест, аммо онро танҳо барои доварӣ истифода бурдан мумкин аст.

(3) Аз сабаби ҳассосияти қавӣ он ба осонӣ ба вуҷуд омадани аэрозолҳо аст, ки боиси мусбати бардурӯғ мегардад ва ба натиҷаҳои санҷиш таъсир мерасонад.

Sтақвияти ҷобаҷогузории транд

Амплификацияи ҷобаҷогузории ришта (SDA) як усули амплификацияи изотермии ДНК дар vitro аст, ки ба реаксияи ферментативӣ асос ёфтааст, ки бори аввал аз ҷониби олими амрикоӣ Уокер дар соли 1992 пешниҳод шудааст.

Системаи асосии SDA аз эндонуклеазаи маҳдудкунанда, полимеразаи ДНК бо фаъолияти ҷобаҷогузории риштаҳо, ду ҷуфт праймерҳо, dNTPҳо, ионҳои калсий ва магний ва системаҳои буферӣ иборат аст.

Принсипи амплификатсияи ҷобаҷогузории ришта ба пайдарпаии шинохти маҳдудкунии эндонуклеазаҳои аз ҷиҳати кимиёвӣ тағйирёфта дар ҳарду канори ДНК ҳадаф асос ёфтааст.Эндонуклеаза холигии риштаи ДНК-ро дар макони шинохти худ мекушояд ва полимеразаи ДНК холигии 3'-ро дароз мекунад ва риштаи навбатии ДНК-ро иваз мекунад.

Рӯйҳои ягонаи ДНК-и ивазшударо бо праймерҳо муттаҳид кардан мумкин аст ва тавассути полимеразаи ДНК ба риштаҳои дукарата дароз карда мешавад.Ин раванд пайваста такрор карда мешавад, то пайдарпаии ҳадаф ба таври муассир афзоиш ёбад.

Афзалиятҳо ва нуқсонҳои технологияи амплификатсияи ҷобаҷогузории ришта

Афзалиятҳои SDA:

Самаранокии амплификация баланд аст, вақти реаксия кӯтоҳ аст, хосият қавӣ аст ва таҷҳизоти махсус талаб карда намешавад.

Камбудиҳои SDA:

Маҳсулот якранг нестанд ва баъзе маҳсулоти якқатор ва дуқатор ҳамеша дар давраи SDA истеҳсол мешаванд ва ҳангоми ошкор кардани электрофорез думҳо ногузир ба амал меоянд.

Rпурзӯркунии доира

Амплификацияи гардиши даврӣ (RCA) бо роҳи кашидани усули нусхабардории ДНК аз организмҳои патогенӣ тавассути гардиши давр пешниҳод карда мешавад.Он ба истифодаи ДНК-и якқатораи даврашакл ҳамчун қолаб дар ҳарорати доимӣ ва як полимеразаи махсуси ДНК (ба монанди Phi29) ) Дар зери амали гардиши даврии синтези ДНК барои ноил шудан ба ампификацияи гени мақсаднок.

RCA-ро метавон ба амплификацияи хатӣ ва амплификацияи экспоненсиалӣ тақсим кард.Самаранокии RCA хатӣ метавонад ба 10 мерасад⁵маротиба ва самаранокии экспоненсиалии RCA метавонад ба 10 мерасад⁹маротиба.

Фарқияти оддӣ, тавре ки дар расми зер нишон дода шудааст, амплификацияи хатӣ a танҳо 1 праймерро истифода мебарад, амплификацияи экспоненсиалӣ b 2 праймер дорад.

RCA-и хатӣ инчунин RCA-и ягона номида мешавад.Пример ба ДНК-и даврашакл мепайвандад ва бо амали полимеразаи ДНК дароз карда мешавад.Маҳсулот як риштаи ягонаи хаттӣ буда, шумораи зиёди пайдарпайҳои такроршаванда аз ҳазорҳо маротиба дарозии як ҳалқа аст.

Азбаски маҳсули RCA-и хаттӣ ҳамеша ба праймери оғозёбӣ пайваст аст, ба осонӣ насб кардани сигнал бартарии асосӣ аст.

Экспоненсиалии RCA, ки бо номи Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA) низ маъруф аст, дар RCA экспоненсиалӣ, як праймер маҳсулоти RCA-ро тақвият медиҳад, праймери дуюм бо маҳсулоти RCA гибридизатсия мешавад ва васеъ мешавад ва ивазкунӣ аллакай ба маҳсулоти RCA пайваст карда мешавад.

Афзалиятҳо ва нуқсонҳои пурқувваткунии кислотаи нуклеинӣ

Афзалиятҳои RCA:

Ҳассосияти баланд, хосияти хуб ва кори осон.

Камбудиҳои RCA:

Мушкилоти замина ҳангоми муайян кардани сигнал.Ҳангоми реаксияи RCA, зондҳои қулфи гардишнашуда ва қолаби ДНК ё РНК-и зондҳои ҷудошуда метавонанд баъзе сигналҳои заминаро тавлид кунанд. 

Nамплификация дар асоси пайдарпаии уклеицидҳо

Амплификация дар асоси пайдарпаии кислотаи нуклеинӣ (NASBA) технологияи навест, ки дар асоси PCR таҳия шудааст.Ин як тақвияти пайваста ва изотермии кислотаи нуклеинӣ мебошад, ки тавассути як ҷуфт праймерҳо бо пайдарпаии промоутерҳои T7 роҳнамоӣ мекунад.Технология метавонад дар давоми тақрибан 2 соат шаблон РНК-ро тақрибан 109 маротиба афзоиш диҳад, ки ин аз усули анъанавии ПТР 1000 маротиба зиёдтар аст ва таҷҳизоти махсусро талаб намекунад.

Ин технология барои ташхиси фаврии бемориҳо баробари пайдо шуданаш истифода шудааст ва ҳоло бисёр ширкатҳо ин усулро дар маҷмӯаҳои ташхиси РНК истифода мебаранд.

Гарчанде ки амплификацияи РНК метавонад технологияи транскрипсияи баръакси PCR-ро низ истифода барад, NASBA бартариҳои худро дорад: он метавонад дар шароити нисбатан доимии ҳарорат анҷом дода шавад ва он нисбат ба технологияи анъанавии PCR устувортар ва дақиқтар аст.

Реаксия дар ҳарорати 41 дараҷа гарм аст ва барои анҷом додани он AMV (вируси миелобластозҳои парранда), транскриптазаи баръакс, RNase H, T7 RNA полимераза ва як ҷуфт праймерҳоро талаб мекунад.

Раванд асосан дар бар мегирад:

Примери пешқадам дорои пайдарпайии иловагии промоутери T7 мебошад.Ҳангоми реаксия, праймери пеш ба риштаи РНК мепайвандад ва аз ҷониби ферменти AMV катализ карда мешавад, то риштаи дукаратаи ДНК-РНК-ро ташкил кунад.

RNase H РНК-ро дар ду риштаи гибридӣ ҳазм мекунад ва ДНК-и якқаторро нигоҳ медорад.

Дар зери таъсири праймери баръакс ва ферменти AMV, риштаи дугонаи ДНК, ки пайдарпаии промоторҳои T7 дорад, ба вуҷуд меояд.

Дар зери таъсири полимеразаи T7 RNA, раванди транскрипсия ба итмом мерасад ва миқдори зиёди РНК ҳадаф истеҳсол мешавад.

Афзалиятҳои NASBA:

(1) Примери он дорои пайдарпаии промоутерҳои T7 мебошад, аммо ДНК-и дуқабата хориҷӣ пайдарпаии промоутерҳои T7 надорад ва онро тақвият додан мумкин нест, аз ин рӯ ин технология хосият ва ҳассосияти баланд дорад.

(2) NASBA раванди транскрипсияи баръаксро мустақиман ба реаксияи амплификация дохил карда, вақти реаксияро кӯтоҳ мекунад.

Камбудиҳои NASBA:

(1) Ҷузъҳои реаксия мураккабтаранд.

(2) Барои баланд бардоштани арзиши реаксия се намуди ферментҳо лозиманд.