COVID-19 як бемории сироятӣ мебошад, ки бо бемории Синдроми шадиди роҳи нафас ба вуҷуд меояд. Коронавируси навъи 2. Вақте ки шахс сироят меёбад, аломатҳои маъмултарин табларза, сулфа ва кӯтоҳии нафасро дар бар мегиранд.
Намунаҳое, ки барои санҷиш истифода мешаванд, метавонанд тавассути тампонҳои бинӣ ё тампонҳои орофарингеалӣ ҷамъоварӣ карда шаванд.
Усули стандартии ташхиси коронавирус реаксияи занҷири полимеразӣ, ПТР мебошад.Ин усулест, ки дар биологияи молекулавӣ васеъ истифода мешавад.Он метавонад ба зудӣ миллионҳо то миллиардҳо пораҳои мушаххаси ДНК-ро нусхабардорӣ кунад.
Коронавируси нав дорои геноми хеле дарози якқатораи РНК мебошад.Барои ошкор кардани ин вирусҳо тавассути ПТР, молекулаҳои РНК бояд ба пайдарпаии ДНК-и иловагии онҳо тавассути транскриптазаи баръакс табдил дода шаванд ва сипас ДНК-и нав синтезшударо тавассути расмиёти стандартии PCR, ки маъмулан бо номи RT-PCR маълум аст, тақвият додан мумкин аст.
Раванди RT-PCR
истихроҷи РНК
Барои иҷрои ин усул, РНК-и вирусӣ бояд асосан истихроҷ карда шавад.Маҷмӯаҳои гуногуни тозакунии РНК метавонанд барои ҷудокунии қулай, зуд ва муассир истифода шаванд.
Барои истихроҷи РНК вирусӣ бо истифода аз маҷмӯаи тиҷоратӣ, аввал намунаро ба найчаи микроцентрифуга илова кунед ва сипас онро бо буфери лизис омехта кунед.Ин буфер хеле денатурат шудааст ва одатан аз фенол ва изотиоцианати гуанидин иборат аст.Илова бар ин, ингибиторҳои RNase одатан дар буфери лизис мавҷуданд, то ҷудокунии РНК-и вирусии солимро таъмин кунанд.
Пас аз илова кардани буфери лизис, найчаи омехтаро тавассути набз гирдоб кунед ва дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия кунед.Пас аз он, вирус дар шароити хеле денатуратсия, ки аз ҷониби буфери лизис таъмин карда мешавад, лизис карда мешавад.
Пас аз лизи кардани намуна, барои раванди тозакунӣ як найчаи центрифуга истифода мешавад.Намуна ба найчаи центрифуга бор карда мешавад ва сипас центрифуга карда мешавад.
Ин тартиб усули истихроҷи марҳилаи сахт аст, ки дар он марҳилаи статсионарӣ аз матритсаи силикагель иборат аст.
Дар шароити оптималии намак ва рН, молекулаҳои РНК ба мембранаи кремний пайваст мешаванд.
Дар баробари ин, сафеда ва дигар ифлоскунандаҳо хориҷ карда мешаванд.
Пас аз центрифугакунӣ, найчаи центрифугаро ба найчаи тозаи ҷамъоварӣ гузоред, филтратро партоед ва сипас буфери шустанро илова кунед.
Қубурро боз дар центрифуга ҷойгир кунед, то буфери шустанро тавассути мембрана маҷбур созед.Ин ҳама ифлосиҳои боқимондаро аз мембрана хориҷ мекунад ва танҳо РНК-ро ба силикагел пайваст мекунад.
Пас аз шустани намуна, найчаро ба найчаи тозаи микроцентрифуга гузоред ва буфери элюциониро илова кунед.
Пас аз он центрифуга карда мешавад, то буфери элюциониро тавассути мембрана маҷбур созад.Буфери элюционӣ РНК-и вирусиро аз сутуни спид хориҷ мекунад ва РНК-и тозашударо аз сафедаҳо, ингибиторҳо ва дигар ифлоскунандаҳо ба даст меорад.
Консентрати омехта
Пас аз истихроҷи РНК вирусӣ, қадами навбатӣ омода кардани омехтаи реаксия барои тақвияти ПТР мебошад.Дар ин марҳила, консентрат истифода мешавад.Ин маҳлули консентратсиони маҳлули консентратсияи пешакӣ омехташуда мебошад, ки аз премикс, транскриптазаи баръакс, нуклеотидҳо, праймери пеш, праймери баръакс, зонд TaqMan ва полимеразаи ДНК иборат аст.
Ниҳоят, барои анҷом додани ин омехтаи реаксия, қолаби RNA илова карда мешавад.Қубурҳо бо гардиши пулс омехта карда мешаванд ва сипас омехтаи реаксия ба пластинкаи ПТР бор карда мешавад.Пластинкаи PCR одатан 96 чоҳро дар бар мегирад ва метавонад дар як вақт якчанд намунаҳоро таҳлил кунад.
амплификацияи PCR
Баъдан, табақро дар мошини PCR ҷойгир кунед, ки аслан як сикли гармидиҳӣ аст.
RT-PCR дар вақти воқеӣ барои ошкор кардани коронавируси нави соли 2019 тавассути тақвият додани пайдарпаии ҳадаф дар гени RdrRP, гени E ва гени N истифода мешавад.Интихоби гени мақсаднок аз пайдарпаии ибтидоӣ ва зонд вобаста аст.
Қадами аввалини RT-PCR транскрипсияи баръакс мебошад.Қатори якуми ДНК-и комплементарӣ синтез карда мешавад, ки онро праймери баръакси ПТР оғоз мекунад, ки ба қисми комплементарии геноми РНК вирусӣ мепайвандад.Сипас транскриптазаи баръакс нуклеотидҳои ДНК-ро ба 3′-охири праймер илова мекунад, то ДНК-и пурраи РНК-и вирусиро синтез кунад.Ҳарорат ва давомнокии ин қадам аз праймерҳо, РНК-и мақсаднок ва транскриптазаи баръакс вобаста аст.
Баъдан, қадами ибтидоии денатуратсия татбиқ карда мешавад, ки боиси денатуратсияи гибриди РНК-ДНК мегардад.Ин қадам барои фаъол кардани полимеразаи ДНК зарур аст.Дар айни замон, транскриптазаи баръакс ғайрифаъол мешавад.
PCR аз як қатор давраҳои гармидиҳӣ иборат аст.Ҳар як давра аз қадамҳои денатуратсия, тозакунӣ ва васеъшавӣ иборат аст.
Марҳилаи денатуратсия гарм кардани камераи реаксияро то 95 дараҷа гарм ва истифодаи он барои денатуратсияи қолаби дуқабата ДНК дар бар мегирад.
Дар қадами навбатӣ, ҳарорати реаксия то 58 дараҷа паст карда мешавад, ки ба праймери пеш имкон медиҳад, ки ба қисми иловагии қолаби якқатораи ДНК пайваст шавад.Ҳарорати тозакунӣ бевосита аз дарозӣ ва таркиби праймер вобаста аст.
Дар марҳилаи васеъшавӣ, полимеразаи ДНК як риштаи нави ДНК-ро синтез мекунад, ки ба риштаи қолаби ДНК мукаммал аст.Бо илова кардани ядроҳои ройгон ба шаблон дар самти 5'то 3'аз омехтаи реаксия.Ҳарорати ин марҳила аз полимеразаи ДНК истифодашаванда вобаста аст.
Пас аз давраи аввал ҳадафи ДНК-и дуқабата ба даст оварда мешавад.
Сипас, давраи дуюмро ворид кунед.ДНК-и дуқатор денатурат карда мешавад, то ду молекулаи ДНК-и якқаторро тавлид кунад.
Дар қадами навбатӣ, ҳарорати реаксия паст карда мешавад, праймерҳо ба ҳар як қолаби якқатораи ДНК ва зондҳои Taq-man ба қисми пурраи ДНК-и ҳадаф гарм карда мешаванд.
Зондҳои TaqMan аз фторфор иборат аст, ки ба 5′-нӯги зондҳои олигонуклеотид ба таври ковалентӣ пайвастанд.Ҳангоми ба ҳаяҷон омадани манбаи рӯшноии циклер, флюорофор флуоресцентсия медиҳад.Илова бар ин, зонд аз як хомӯшкунанда дар 3′-охири иборат аст.Наздик будани гени хабарнигор ба хомӯшкунанда барои ошкор кардани флуорессенсия монеъ мешавад.
Дар марҳилаи васеъшавӣ, полимеразаи ДНК як риштаи навро синтез мекунад.Вақте ки полимераз ба зондҳои TaqMan мерасад, фаъолияти эндогении 5′нуклеазаи он зондро ҷудо мекунад ва рангро аз хомӯшкунанда ҷудо мекунад.
Бо ҳар як давраи ПЗР, молекулаҳои бештари рангҳо бароварда мешаванд, ки дар натиҷа шиддатнокии флуоресцент ба миқдори ампликонҳои синтезшуда мутаносиб зиёд мешавад.
Ин усул имкон медиҳад, ки шумораи пайдарпайии додашуда дар намуна муайян карда шавад.Миқдори порчаҳои ДНК-и дуқабата дар ҳар як давра ду баробар меафзояд.Аз ин рӯ, PCR метавонад барои таҳлили намунаҳои хеле хурд истифода шавад.
Барои чен кардани сигнали флуоресцентӣ, лампаи галогении вольфрам, филтри барангезанда, рефлектор, линза, филтри эмиссия ва заряди бо дастгоҳи пайвастшуда камераи CCD-ро истифода мебарад.
ҚАДАМИ 4 Муайян кардан
Барои чен кардани сигнали флуоресцентӣ, лампаи галогении вольфрам, филтри барангезанда, рефлектор, линза, филтри эмиссия ва заряди бо дастгоҳи пайвастшуда камераи CCD-ро истифода мебарад.
Нури филтршудаи лампа тавассути рефлектор инъикос ёфта, аз линзаи конденсатор мегузарад ва ба маркази ҳар сӯрох равона карда мешавад.Пас аз он флуорессенсияе, ки аз сӯрох хориҷ мешавад, аз оина инъикос ёфта, аз филтри эмиссия мегузарад ва аз ҷониби камераи CCD муайян карда мешавад.Дар ҳар як давраи PCR, нури худидоракунии флюорофорро аз ҷониби CCD муайян кардан мумкин аст.
Он нури гирифташударо ба маълумоти рақамӣ табдил медиҳад.Ин усул дар вақти воқеӣ PCR номида мешавад ва он имкон медиҳад, ки дар вақти воқеӣ пешрафти реаксияи PCR назорат карда шавад.
Вақти фиристодан: июл-19-2021