Ҳамчун як лабораторияи нав дар лаборатория, аз як хӯшаи растаниҳо бо суръати пасти табдил додани растаниҳои мусбӣ кори хуб нест.Аввалан, ДНК бояд аз миқдори зиёди намунаҳо як ба як истихроҷ карда шавад ва сипас генҳои хориҷӣ тавассути PCR муайян карда мешаванд.Бо вуҷуди ин, натиҷаҳо аксар вақт холӣ ва бандҳо бо якчанд ҷузъҳо мебошанд, аммо муайян кардан ғайриимкон аст, ки оё кашфиётҳои гумшуда ё ошкоркунии бардурӯғ вуҷуд доранд..Оё бо чунин раванд ва натиҷаҳои таҷрибавӣ рӯ ба рӯ шудан хеле нотавон аст?Парво накунед, бародар ба шумо тарзи скрининги растаниҳои трансгении мусбатро осон ва дақиқ таълим медиҳад.

Қадами 1

Примерҳои муайянкунии тарҳрезӣ

Генҳои эндогенӣ ва гени экзогениро, ки мувофиқи намунаи санҷидашаванда муайян карда мешаванд, муайян кунед ва пайдарпаии намояндагии 100-500bp-ро дар ген барои тарҳрезии ибтидоӣ интихоб кунед.Примерҳои хуб метавонанд дақиқии натиҷаҳои ошкорро таъмин кунанд ва вақти муайянкуниро кӯтоҳ кунанд (ниг.

Огоҳӣ: Примерҳои нав тарҳрезишуда бояд шароити реаксияро оптимизатсия кунанд ва дақиқӣ, дақиқӣ ва лимити ошкоркуниро пеш аз кашфи миқёси васеъ тафтиш кунанд.

Қадами 2

Тарҳрезии протоколи таҷрибавӣ

Назорати мусбӣ: ДНК-и тозашудаи дорои порчаи ҳадафро ҳамчун қолаб истифода баред, то муайян кунед, ки оё системаи реаксияи ПТР ва шароитҳо муқаррарӣ ҳастанд.

Назорати манфӣ/холӣ: Шаблони ДНК ё ddH2O-ро, ки порчаи мавриди ҳадафро ҳамчун қолаб дар бар намегирад, барои муайян кардани мавҷудияти манбаи олудашавӣ дар системаи ПТР истифода баред.

Назорати истинодҳои дохилӣ: омезиши ибтидоӣ/зонди гени эндогении намунаро барои санҷида истифода баред, то ки оё қолабро тавассути PCR муайян кардан мумкин аст ё на.

Огоҳӣ:

Барои ҳар як санҷиш барои арзёбии дурустии натиҷаҳои таҷрибавӣ бояд назорати мусбӣ, манфӣ/блокӣ ва назорати дохилӣ муқаррар карда шавад.

Тайёр кардани таҷриба

Пеш аз истифода, мушоҳида кунед, ки маҳлул баробар омехта шудааст ё не.Агар боришот пайдо шавад, пеш аз истифода онро мувофиқи дастурҳо ҳал ва омехта кардан лозим аст.Омехтаи 2×PCR бояд пеш аз истифода пипета карда шавад ва такроран бо микропипета омехта карда шавад, то тақсимоти нобаробари ионҳоро пешгирӣ кунад.

Огоҳӣ:

Дастурро бароварда, бодиккат хонед ва пеш аз тачриба катъиян мувофики талаби дастурамал тайёрй бинед.

Қадами 4

Системаи реаксияи PCR омода кунед

Тибқи протоколи таҷрибавӣ, праймерҳо, H2O ва 2×PCR-ро баробар омехта кунед, центрифуга кунед ва онҳоро ба ҳар як найчаи реаксия тақсим кунед.

Огоҳӣ:

Барои санҷиши миқёси калон ё дарозмуддат тавсия дода мешавад, ки системаи реаксияи PCR дорои ферментҳои UNG мебошад, ки метавонад ифлосшавии аэрозолро, ки аз маҳсулоти ПТР ба вуҷуд омадааст, пешгирӣ кунад.

Қадами 5

Шаблони реаксияро илова кунед

Бо истифода аз технологияи мустақими PCR, ба раванди тозакунии кислотаи нуклеинӣ лозим нест, қолаби намунаро дар давоми 10 дақиқа омода кардан мумкин аст ва системаи реаксияи PCR-ро илова кардан мумкин аст.

Огоҳӣ:

Усули ҷудокунӣ таъсири беҳтари муайянкунанда дорад ва маҳсулоти бадастомада метавонад барои реаксияҳои муайянкунии сершумор истифода шавад.

5.1: Тавсеаи бевоситаи баргҳо

Мувофики андозаи расми дар дастур додашуда бофтаи барги диаметраш 2-3мм бурида, дар системаи реаксияи ПТР ҷойгир кунед.

Эзоҳ: Боварӣ ҳосил кунед, ки пораҳои баргҳо пурра дар маҳлули реаксияи PCR ғарқ шудаанд ва бофтаи баргҳои аз ҳад зиёд илова накунед.

5.2: Усули тақсим кардани барг

Бофтаи баргро бо диаметраш 5—7 мм бурида, ба найчаи центрифуга гузоред.Агар шумо баргҳои баркамолро интихоб кунед, лутфан аз истифодаи бофтаҳои рагҳои асосии барг худдорӣ кунед.Лизати 50ul Buffer P1-ро пипетка ба найчаи центрифуга резед, то боварӣ ҳосил кунед, ки лизат метавонад бофтаи баргро пурра ғарқ кунад, онро дар циклери термикӣ ё ваннаи металлӣ ҷойгир кунед ва дар ҳарорати 95 ° C барои 5-10 дақиқа лиза кунед.

Маҳлули безараргардонии 50ul Buffer P2 илова кунед ва хуб омехта кунед.Лизати ҳосилшуда метавонад ҳамчун қолаб истифода шавад ва ба системаи реаксияи PCR илова карда шавад.

Эзоҳ: Миқдори қолаб дар байни 5-10% системаи PCR аст ва набояд аз 20% зиёд бошад (масалан, дар системаи PCR 20μl, 1-2μl маҳлули лизис илова кунед, на бештар аз 4μl).

Қадами 6

Реаксияи PCR

Пас аз центрифуга кардани найчаи реаксияи ПЗР, он дар асбоби ПТР барои пурқувваткунӣ ҷойгир карда мешавад.

Огоҳӣ:

Реаксия барои амплификатсия қолаби тозанашударо истифода мебарад, бинобар ин шумораи давраҳои пурқувваткунӣ нисбат ба истифодаи қолаби тозашудаи ДНК 5-10 давра зиёд аст.

Қадами 7

Муайян кардани электрофорез ва таҳлили натиҷаҳо

M: 100bp нардбони ДНК

1\4: Усули тозашудаи ДНК

2\5: Усули бевоситаи PCR

3\6: Назорати холӣ

QC:

Натичахои санчиши асбобхои гуногуни назорати дар тачриба мукарраршуда бояд ба шартхои зерин чавоб диханд.Дар акси ҳол, бояд сабаби мушкилот таҳлил карда шавад ва пас аз бартараф кардани мушкилот, санҷиш бояд дубора анҷом дода шавад.

Ҷадвали 1. Натиҷаҳои санҷиши муқаррарии гурӯҳҳои гуногуни назоратӣ

* Вақте ки плазмид ҳамчун назорати мусбӣ истифода мешавад, натиҷаи санҷиши генҳои эндогенӣ метавонад манфӣ бошад

Натиҷаи ҳукм:

A. Натиҷаи санҷиши гени эндогении намуна манфӣ аст, ки ин нишон медиҳад, ки ДНК-и барои муайянкунии оддии ПТР мувофиқ аз намуна гирифта намешавад ё ДНК-и истихроҷшуда дорои ингибиторҳои реаксияи ПТР мебошад ва ДНК бояд дубора истихроҷ карда шавад.

B. Натиҷаи санҷиши гени эндогении намуна мусбат аст ва натиҷаи санҷиши гени экзогенӣ манфӣ аст, ки нишон медиҳад, ки ДНК мувофиқ барои ташхиси оддии PCR аз намуна истихроҷ карда мешавад ва метавон ҳукм кард, ки гени XXX дар намуна ошкор нашудааст.

C. Натиҷаи санҷиши гени эндогении намуна мусбат аст ва натиҷаи санҷиши гени экзогенӣ мусбат аст, ки аз он шаҳодат медиҳад, ки ДНК-и барои ташхиси оддии ПТР мувофиқ аз намуна истихроҷ шудааст ва ДНК-и намуна гени ХХХ-ро дар бар мегирад.Таҷрибаҳои тасдиқкуниро метавон минбаъд анҷом дод.

Қадами 8

Примерҳои муайянкунии тарҳрезӣ

Пас аз таҷриба, маҳлули 2% гипохлориди натрий ва 70% маҳлули этанолро барои тоза кардани майдони таҷрибавӣ барои пешгирии ифлосшавии муҳити зист истифода баред.