Маслиҳатҳо барои беҳтар кардани барқарорсозии ширеш

1. Ҳангоми электрофорез сарбории намунаро зиёд кунед.

2. Буфери электрофорези нав тайёршударо истифода баред.

3. Ҳангоми буридани ширеше, кӯшиш кунед, ки танҳо ширешро бо тасмаҳо буред, то ҳаҷми буридани ширешро кам кунед: ширеш бо чанд пораи таъиншуда лозим нест, вагарна он ба суръати барқароршавӣ таъсир мерасонад.

4. Пас аз гудохтани ду ё зиёда дона ширеше, новобаста аз он ки њаљми он чї ќадар калон аст, найчаро истифода баред ва онро ба њамон сутун гузаронед.

5. Маҳлули дар сол иловашуда метавонад каме бештар бошад, ки барои пайвастшавии ДНК ба мембрана бештар мусоидат мекунад, аммо умуман аз 750ul зиёд нест.

6. Калиди барќарорсозии gel ин пайваст кардани ДНК ба сутун тавассути консентратсияи намак, кислотањо (заряд) ва гидрофоб будани мањлул дар сутун мебошад.Бинобар ин, агар рН буфери электрофорез хеле баланд бошад, ба зол 10ул (рН 5,0, 3мол/л NaAC) илова кардан мумкин аст;бо мақсади беҳтар гирифтани молекулаҳои ДНК дар мембрана 30% изопропанолро барои гарм кардани моеъ пас аз обшавии ширеше илова кардан мумкин аст.

7. Пеш аз илова кардани элюент, сутунро дар ҳарорати хонагӣ барои чанд дақиқа (тақрибан 10 дақиқа) гузоред, то ки этанол пурра бухор шавад.

8. Ниҳоят, барои кам кардани ҳаҷми барқарорсозӣ камтар элюент илова кунед.Умуман, 30-50мкл элюент барои элюсия истифода мешавад (на он қадар кам нест, вагарна мембранаро тар карда наметавонад, ки ба элюсия мусоидат намекунад);қатраҳои элютсионӣ дар маркази мембрана ҷойгиранд, то ДНК-и ба мембрана пайвастшударо пурра элюта кунанд.

9. Пас аз илова кардани элюент, онро дар ваннаи обии 55 дараҷа барои 5 дақиқа ё дар ваннаи обии 50 дараҷа барои зиёда аз 10 дақиқа ҷойгир кардан мумкин аст ё бо парафилм дар 4 дараҷа як шабонарӯз мӯҳр карда, пас аз рӯзи дигар барои барқароршавӣ центрифуга кардан мумкин аст, таъсири хуб аст.

10. Элюати центрифугашударо дубора ба сутуни адсорбсия илова кунед ва дубора центрифуга кунед.

Усулҳо ва тартиби муфассал барои барқарорсозии маҳсулоти PCR

1. Коркарди оддии каучук

Агар шумо хоҳед, ки ширешро барқарор кунед, беҳтар аст, ки маҷмӯаро истифода баред, ки қулай аст ва суръати барқароршавӣ каме баландтар аст.Агар ба шумо воқеан лозим аст, ки онро дастӣ барқарор кунед, шумо метавонед пас аз буридани ширеш 3 маротиба ҳаҷми TE илова кунед.Баъди дар ванна об гудохтан фенол, фенол/хлороформ тоза гирифта, этанол борид.Ана тамом.

2. Барқарорсозии ДНК аз gels нуқтаи обшавии паст

Тозакунии порчаҳои ДНК TE (10 ммоль/л Tris-HCl pH8.0, 0,1 ммоль/л ЭДТА) ба ҳаҷми гелро илова кунед ва дар ваннаи обии ҳарорати 65°С барои 5 дақиқа ҷойгир кунед, то гелро пурра ҳал кунад.

Пас аз он ки он ба ҳарорати хонагӣ оварда шуд, ба миқдори баробар фенол (дар қабати боло бо TE сер карда шудааст, ТЭ маҳкам карда шуд ва қабати поёнии фенол хориҷ карда шуд) илова карда шуд ва омехта бо нарм омехта карда шуд (омезиш лозим нест) ва дар 12000 чархзанӣ барои 3 дақиқа центрифуга карда мешавад.1-2 маротиба такрор кунед.

Молро гирифта, 0,1 ҳаҷм 3мол/л ацетати натрий (рН 5,2) ва 2,5 маротиба ҳаҷми этаноли мутлақро илова кунед, то боришоти этанолро анҷом диҳед.ДНК-и тозашударо бо миқдори мувофиқи ТЭ маҳлул кунед, мундариҷаро чен кунед ва барои истифода омода кунед (онро барои таҳлили сохтори генҳои мақсаднок, тайёр кардани зонд ва ғайра истифода бурдан мумкин аст).

3. Барќарорсозии PCR бо хусусияти амплификацияи хуб

Агар хусусияти амплификацияи ПТР хуб бошад, он танҳо як тозакунии оддӣ ва барқарорсозии маҳсулоти PCR аст.Шумо метавонед 50гг/мл протеиназа К-ро ба маҳсулоти ПТР илова кунед, 37 дараҷа барои 1 соат, як маротиба бо фенол/хлороформ экстракция кунед, як маротиба бо хлороформ экстракция кунед ва 0,1 ҳаҷми супернатант илова кунед.Ацетат натрий тавассути боришот бо 2,5 ҳаҷми этаноли мутлақ барқарор карда шуд.

Маҳсулоти марбут:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/