Транскриптазаҳои баръакси анъанавӣ ба ҳарорати баланд тоб оварда наметавонанд (ҳарорати оптималии фаъолияти MMLV 37-50°С ва AMV 42-60°С).РНК-и вирусии мураккабтарро дар ҳарорати паст ба cDNA ба таври муассир иваз кардан мумкин нест, ки дар натиҷа самаранокии муайянкунӣ коҳиш меёбад.RT-qPCR анъанавӣ умуман иштироки ду ферментҳои калидиро талаб мекунад (транскриптазаи баръакс ва полимеразаи ДНК), ки содда кардани кори системаи реаксия ва кам кардани хароҷотро ғайриимкон месозад.Дар ин ҷо мо ду транскриптазаи баръакси ба ҳарорати баланд тобоварро ҷорӣ мекунем, TtH ва RevTaq.Ин ду фермент инчунин вазифаи полимеразаи ДНК-ро доранд, бинобар ин онҳоро ферментҳои дуфункционалӣ меноманд.

TtH ДНК полимераза

Шумо бояд дар бораи TtH, ки аз бактерияи термофилии Thermus thermophilus HB8 гирифта шудааст, шунидаед.Дар ҳузури катионҳои дувалентӣ ба монанди Mg2+, он дорои фаъолияти полимеразаи ДНК мебошад.Он дар реаксияҳои PCR ба монанди enzyme Taq васеъ истифода мешавад, аммо он нисбат ба ферментҳои Taq муқовимати гармии баландтар дорад, аз ин рӯ он инчунин ба PCR бо қолибҳои баланди GC таъсири беҳтар дорад.

· Ин фермент аслан фаъолияти 3′→5′ экзонуклеаза ва 5′→3′ экзонуклеаза надорад, аз ин рӯ онро барои пайдарпайии дидеокси низ истифода бурдан мумкин аст.

· Ин фермент дорои фаъолияти RTase мебошад.Дар ҳузури Mn2+, фаъолияти RTase афзоиш меёбад.Бо истифода аз ин хусусият, он метавонад барои иҷрои реаксияи транскрипсияи баръакс ва реаксияи PCR дар як найча, яъне як қадами RT-PCR истифода шавад.Аммо, дар сурати мавҷудияти Mn2+, дақиқии RT-PCR баланд нест.Фаъолияти RT бо фаъолияти rnaase H ҳеҷ иртиботе надорад.

· Фаъолияти афзояндаи полимерази Tth-DNA (pH9, оптималӣ +55℃～+70℃, максимум +95℃) мушкилоти аз сохтори дуюмдараҷаи РНК ба вуҷуд омадаро бартараф мекунад.cDNA-и ҳосилшуда метавонад тавассути PCR бо ҳамон фермент дар ҳузури ионҳои Mg2+ тақвият дода шавад.

· Қобилияти полимеразаи Tth-DNA барои иҷрои транскрипсияи баръакс ва амплификацияи ДНК дар ҳарорати баланд ин ферментро барои RT-PCR миқдорӣ, клонкунӣ ва таҳлили экспрессияи генҳои РНК-и ҳуҷайравӣ ва вирусӣ муфид мегардонад.
· Полимераза Tth-DNA барои RT-PCR барои тақвият додани РНК то 1кб истифода мешавад.

Хусусиятҳо ва афзалиятҳо

Tth ДНК полимераза:

• Боварӣ ҳосил кунед, ки андозаи маҳсулоти оптимизатсияшудаи реаксияи занҷири полимеразӣ (PCR), ҳадди аққал 1000 бит дар реаксияи RT-PCR

• Трифосфати дезоксирибонуклеозидҳои тағирёфтаро ҳамчун субстрат қабул кунед

• Ба фаъолияти RNase H алоқаманд нест

• Барои бартараф кардани мушкилот, ки одатан ба сохтори баланди дуюмдараҷа дар РНК мавҷуд аст, устувории баланди гармӣ дорад

RevTaq RT-ПТР ДНК полимераза

Полимеразаи ДНК ба гармӣ тобовар бо фаъолияти транскриптаза баръакс

RevTaq-RT-PCR-ДНК полимераза як ферменти тарҳрезишуда, ба гармии баланд тобовар, дуфунксионалии дорои транскриптазаҳои баръакс ва полимеразаи ДНК мебошад, ки тавассути эволютсияи мустақим ва сунъӣ ба даст оварда шудааст.

· Нисфинафарии RevTaq RT-PCR ДНК полимераза дар 95°С аз 40 дақиқа зиёд аст.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимераза имкон медиҳад, ки транскрипсияи баръакси ҳарорати баланд мустақиман аз қолаби РНК сурат гирад ва қадами транскрипсияи баръакс барои тавлиди қолибҳои бештари cDNA метавонад чанд маротиба такрор карда шавад.

· Полимеразаи ДНК RevTaq RT-PCR имкон медиҳад, ки RT-PCR «сифр-қадам» (қадами транскрипсияи баръакси изотермикӣ вуҷуд надорад), зеро дар қадами тамдиди циклии ПТР транскрипсияи баръакс ва амплификацияи ДНК ҳамзамон ба амал меоянд.Ин инчунин ба реаксияи транскрипсияи баръакс дар ҳарорати баланд мусоидат мекунад ва ба ин васила мушкилотеро, ки ҳангоми гудохтани сохтори дуюмдараҷаи қавӣ дар РНК дар ҳарорати баланд дучор мешаванд, кам мекунад.

· Аз сабаби формулаи гарм-оғозӣ дар асоси aptamer, RevTaq RT-PCR ДНК полимераза ҳангоми гармкунӣ ва васеъшавии ҳарорати аз 57°C баландтар натиҷаҳои беҳтар медиҳад.

· Азбаски фермент ба гармӣ тобовар аст, тавсия дода мешавад, ки праймерҳо ва зондҳо бо нуқтаи обшавии хеле баланд (>60°C) тарҳрезӣ карда шаванд.

· Тавсия дода мешавад, ки ҳарорати марҳилаи таҳшин/таздид тавассути градиенти ҳарорат дар ҷараёни танзими реаксия оптимизатсия карда шавад.

· Ҳарорати баландтар, хосияти ПЗР баландтар аст.Давраи транскрипсияи баръакс одатан дар ҳарорати баландтар аз давраи PCR анҷом дода мешавад, зеро гибридизатсияи DNA Primer: RNA Template одатан нисбат ба дуплекси DNA Primer:cDNA Template нуқтаи обшавии баландтар дорад.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимераза аз ҷиҳати генетикӣ таҳия ва оптимизатсия карда шудааст ва андозаи ампликон дар байни 60-300 bp аст.

Ҳадди муайянкунии полимерази ДНК RevTaq RT-PCR ба 4 нусха мерасад/

Системаи реаксияи оптимизатсияшуда (таъсиси праймерҳои нуқтаи обшавии баланд) дар расм нишон дода шудааст.RevTaq RT-PCR ДНК полимерази RT-PCR нисбат ба омехтаи мастери 1-қадам RT-qPCR TaqPath ҳассосияти беҳтар ва градиенти ҳалкунии намунаро ошкор мекунад.

Афзалиятҳои бештар:

Функсияи оғози зуд → Қадами ибтидоии денатуратсияи гармиро гузаронидан мумкин аст.

Формулаи аптамери гарм-оғози → Фаъолияти 100% ферментро фавран таъмин кунед ва дар ҳарорати паст (<57°C) амплификацияи ғайримуқаррариро пешгирӣ кунед.

Функсияи ҷудошавӣ → Қадами истихроҷи РНК сарфи назар карда шудааст, зеро RevTaq RT-PCR полимеразаи ДНК инчунин метавонад намунаҳои реаксияи хомро коркард кунад.Он метавонад фавран мембранаҳои ҳуҷайраи эукариотҳо, бактерияҳо ва вирусҳоро дар як давраи гарми RT-PCR нобуд кунад.

Сатҳи ашёи хоми IVD → стандартҳои баланди сифат ва нархҳои хеле рақобатпазир