• Фейсбук
  • Linkedin
  • youtube

Маводи ибтидоӣ: РНК

Миқдори транскрипсияи баръакси PCR (RT-qPCR) як усули таҷрибавӣ мебошад, ки дар таҷрибаҳои PCR бо истифода аз РНК ҳамчун маводи ибтидоӣ истифода мешавад.Дар ин усул, РНК-и умумӣ ё паёмнависии РНК (mRNA) аввал ба ДНК-и комплементарӣ (cDNA) тавассути транскриптазаи баръакс транскрипт карда мешавад.Баъдан, реаксияи qPCR бо истифода аз cDNA ҳамчун қолаб анҷом дода шуд.RT-qPCR дар барномаҳои гуногуни биологияи молекулавӣ, аз ҷумла таҳлили ифодаи генҳо, тасдиқи дахолати РНК, санҷиши микроаррей, ошкор кардани патоген, санҷиши генетикӣ ва таҳқиқоти беморӣ истифода шудааст.

Усулҳои як қадам ва ду қадам барои RT-qPCR

RT-qPCR метавонад бо усули як қадам ё ду қадам анҷом дода шавад.Як қадами RT-qPCR транскрипсияи баръакс ва амплификацияи ПТР-ро муттаҳид мекунад, ки ба транскриптазаи баръакс ва полимеразаи ДНК имкон медиҳад, ки реаксияро дар як найча дар як шароити буферӣ анҷом диҳанд.Як қадами RT-qPCR танҳо истифодаи праймерҳои пайдарпайро талаб мекунад.Дар ду марҳилаи RT-qPCR, транскрипсияи баръакс ва амплификацияи PCR дар ду найча бо истифода аз буферҳои гуногуни оптимизатсияшуда, шароити реаксия ва стратегияҳои тарроҳии праймер анҷом дода мешавад.

моддаи 1

 

Афзалият

Камбудӣ

Як қадам Ин усул хатогии камтари таҷрибавӣ дорад, зеро ҳарду реаксияҳо дар як қубур анҷом дода мешаванд

 

Қадамҳои камтари пиптинг хатари ифлосшавиро коҳиш медиҳанд

 

Муносиб барои пурқуввати баланд/скрининг, зуд ва такроршаванда

Реаксияҳои ду марҳиларо алоҳида оптимизатсия кардан мумкин нест

 

Азбаски шароити реаксия бо омезиши реаксияи дуқадамӣ халалдор мешавад, ҳассосият он қадар хуб нест, ки усули дуқадам.

 

Шумораи ҳадафҳое, ки аз ҷониби як намуна муайян карда шудаанд, кам аст

Ду қадам Қобилияти эҷоди китобхонаҳои устувори cDNA, ки метавонанд барои муддати тӯлонӣ нигоҳ дошта шаванд ва дар реаксияҳои гуногун истифода шаванд

 

Генҳои мақсаднок ва генҳои истинодро метавон аз як китобхонаи cDNA бидуни ниёз ба китобхонаҳои сершумори cDNA афзоиш дод

 

Буферҳои реаксия ва шароити реаксия, ки оптимизатсияи як реаксияро имкон медиҳанд

 

Интихоби чандири шароити триггер

Истифодаи қубурҳои сершумор ва қадамҳои бештари пиппатсия хатари олудашавии ДНК-ро зиёд мекунад,

ва вақтро сарф мекунад.

 

Назар ба усули як қадам оптимизатсияи бештарро талаб мекунад

Маҳсулоти марбут:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Як қадам)-SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Як қадам)-Тақман

RT Easyᵀᴹ I Master Premix барои синтези аввалини CDNA

Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Вақти воқеӣ PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Интихоби умумии РНК ва mRNA

Ҳангоми тарҳрезии таҷрибаи RT-qPCR, муҳим аст, ки қарор қабул кард, ки оё РНК-и умумӣ ё mRNA-и тозашуда ҳамчун қолаб барои транскрипсияи баръакс истифода мешавад.Гарчанде ки mRNA метавонад ҳассосияти каме баландтарро таъмин кунад, РНК-и умумӣ ҳоло ҳам зуд-зуд истифода мешавад.Сабаби ин дар он аст, ки РНК-и умумӣ нисбат ба mRNA ҳамчун маводи ибтидоӣ бартарии муҳимтар дорад.Аввалан, ин раванд қадамҳои камтари тозакуниро талаб мекунад, ки барқарорсозии миқдорӣ беҳтари қолаб ва беҳтар ба эътидол овардани натиҷаҳоро барои оғози рақамҳои ҳуҷайра таъмин мекунад.Дуюм, он қадами ғанисозии mRNA-ро пешгирӣ мекунад, ки метавонад аз имкони ба даст овардани натиҷаҳои каҷ бо сабаби барқарорсозии гуногуни mRNA-ҳои гуногун пешгирӣ кунад.Умуман, азбаски дар аксари барномаҳо миқдори нисбии гени мақсаднок аз ҳассосияти мутлақи ошкор муҳимтар аст, дар аксари ҳолатҳо РНК умумӣ мувофиқтар аст.

Примери транскрипсияи баръакс

Дар усули дуқадам, се усули гуногунро барои пешбурди реаксияи cDNA истифода бурдан мумкин аст: праймерҳои олиго (dT), праймерҳои тасодуфӣ ё праймерҳои ба пайдарпай хос.Одатан, праймерҳои олиго (dT) ва праймерҳои тасодуфӣ дар якҷоягӣ истифода мешаванд.Ин праймерҳо ба риштаи mRNA-и шаблон пайваст мешаванд ва транскриптазаи баръаксро бо нуқтаи ибтидоӣ барои синтез таъмин мекунанд.

моддаи 2

Интихоби праймер Сохтор ва функсия Афзалият Камбудӣ
Олиго(dT) праймер (ё олиго(dT) лангар) Табобати васеъ ба боқимондаҳои тимин дар думи поли(А) mRNA;Олигои лангар (dT) дорои G, C ё A дар охири 3′ (сайти лангар) Синтези cDNA-и пурраи дарозӣ аз mRNA-и поли(А)-думдор

 

Ҳангоми дастрас будани маводи ибтидоӣ истифода мешавад

 

Ҷойгоҳи лангар кафолат медиҳад, ки праймери олиго (dT) ба думи 5′ поли(А) mRNA мепайвандад.

Танҳо барои тақвият додани генҳо бо думҳои поли(А) мувофиқ аст

 

Гирифтани cDNA-и буридашуда аз макони ибтидоӣ*2 дар poly(A)

 

Барои пайваст шудан ба 3' охири *

 

*Дар сурати истифода шудани праймерҳои олиго(dT) лангар ин имкон кам карда мешавад

праймери тасодуфӣ

 

Дарозии 6 то 9 пойгоҳ аст, ки ҳангоми транскрипсияи РНК метавонад ба сайтҳои сершумор пайваст шавад Тавассути ҳама РНКҳо (tRNA, rRNA ва mRNA)

 

Муносиб барои транскриптҳои дорои сохтори дуюмдараҷаи назаррас ё вақте ки маводи ибтидоӣ камтар дастрас аст

 

Ҳосили баланди cDNA

cDNA аз ҳама РНК баръакс транскрипт карда мешавад, ки одатан дилхоҳ нест ва метавонад сигнали mRNA-и мақсаднокро суст кунад

 

cDNA-и буридашударо гиред

праймерҳои пайдарпай Примерҳои фармоишӣ, ки пайдарпаии мушаххаси mRNA-ро ҳадаф қарор медиҳанд китобхонаи махсуси cDNA

 

Беҳтар кардани ҳассосият

 

Истифодаи праймерҳои баръакси qPCR

Танҳо бо синтези як гени ҳадаф маҳдуд аст

Транскриптазаи баръакс

Транскриптазаи баръакс як ферментест, ки РНК-ро барои синтез кардани ДНК истифода мебарад.Баъзе транскриптазаҳои баръакс фаъолияти RNase доранд ва метавонанд пас аз транскрипсия риштаҳои РНК-ро дар риштаҳои гибридии РНК-ДНК вайрон кунанд.Агар он дорои фаъолияти ферментативии RNase набошад, RNaseH метавонад барои самаранокии баландтари qPCR илова карда шавад.Ферментҳои маъмулан истифодашаванда транскриптазаи баръакси вируси лейкемияи Молони ва транскриптазаи баръакси вируси миелобластомаи паррандаро дар бар мегиранд.Барои RT-qPCR, интихоби транскриптазаи баръакс бо термостабилияти баландтар беҳтарин аст, то синтези cDNA дар ҳарорати баландтар анҷом дода шавад, ки транскрипсияи бомуваффақияти РНК-ҳои дорои сохтори дуюмдараҷаро таъмин намуда, фаъолияти пурраи онҳоро дар тамоми реаксия нигоҳ дорад ва дар натиҷа ҳосили cDNA баландтар мешавад.

Маҳсулоти марбут:

Транскриптазаи баръакси M-MLV

Фаъолияти RNase H-и транскриптазаи баръакс

RNaseH қодир аст, ки риштаҳои РНК-ро аз дуплексҳои РНК-ДНК вайрон кунад ва ба синтези самараноки ДНК-и дуқабата имкон медиҳад.Аммо, ҳангоми истифодаи mRNA-и дароз ҳамчун қолаб, РНК метавонад пеш аз мӯҳлат таназзул кунад, ки дар натиҷа cDNA бурида мешавад.Аз ин рӯ, аксар вақт кам кардани фаъолияти RNaseH ҳангоми клонкунии cDNA фоидаовар аст, агар синтези транскриптҳои дароз лозим бошад.Баръакси ин, транскриптазаҳои баръакс бо фаъолияти RNase H аксар вақт барои барномаҳои qPCR муфиданд, зеро онҳо обшавии дуплексҳои РНК-ДНК-ро дар давраи аввали ПТР зиёд мекунанд.

Тарҳрезии ибтидоӣ

Праймерҳои PCR, ки барои қадами qPCR дар RT-qPCR истифода мешаванд, бояд идеалӣ барои фарогирии пайванди эксон-эксонӣ тарҳрезӣ шаванд, ки дар он як праймери амплификация метавонад сарҳади воқеии экзон-интронро фаро гирад.Азбаски пайдарпаии ДНК-и геномии дорои интрон тақвият дода намешавад, ин тарҳ хатари пайдоиши мусбатҳои бардурӯғро, ки аз ифлосшавии ДНК геномӣ афзоиш ёфтаанд, коҳиш медиҳад.

Агар праймерҳо барои ҷудо кардани сарҳадҳои экзонҳо ё экзон-эксон тарҳрезӣ карда нашаванд, шояд лозим шавад, ки намунаҳои РНК бо DNase I ё dsDNase бе RNase коркард карда шаванд, то ифлосшавии геномии ДНК хориҷ карда шаванд.

Назорати RT-qPCR

Назорати манфии транскрипсияи баръакс (назорати RT) бояд ба ҳама таҷрибаҳои RT-qPCR барои ошкор кардани ифлосшавии ДНК дохил карда шавад (масалан, ДНК-и геномӣ ё маҳсулоти ПТР аз реаксияҳои қаблӣ).Ин назорат ҳама ҷузъҳои реаксияро дар бар мегирад, ба истиснои транскриптазаи баръакс.Азбаски бо ин назорат транскрипсияи баръакс рух намедиҳад, агар амплификацияи ПТР мушоҳида шавад, эҳтимоли зиёд олудашавӣ аз ДНК аст.


Вақти фиристодан: 02-02-2022