Сутун баста шуд

Пас аз васл кардани сутун, ҳосили РНК коҳиш меёбад ё ҳатто тоза кардани РНК ғайриимкон мешавад ва массаи РНК ба даст овардашуда паст аст.

Таҳлили сабабҳои умумӣ:

1. Танаффусҳои намунавӣ пурра нестанд.

Шикастани намуна боиси баста шудани ДНК-ТОЗА намегардад, дар ҳоле ки ба ҳосилнокӣ ва сифати РНК таъсир мерасонад.Мо тавсия медиҳем, ки амалиёти тези дастосро дар нитрогени кофии моеъ ҳангоми шикастани намунаҳо, Кӯшиш кунед, ки девори ҳуҷайраи намуна, мембранаи ҳуҷайра ва дигар бофтаҳоро пора кунед.Барои намунаҳои растаниҳои полисахаридҳои полиол, мо тавсия медиҳем, ки маҷмӯаи изолятсияи Plant Total RNA PLUS -ро истифода баред.

2. Ҳангоми ҷаббида аз болои намунаи ҷудошуда бо сутуни тозакунии ДНК, таҳшини эҳтимолии тақсимшудаи ҳуҷайра метавонад нафас кашад.

Таҳшинҳои пора-порашудаи ҳуҷайраҳои гирифташуда боиси сутуни РНК-ро ба вуҷуд меоранд, ки ҳангоми иҷрои амалиёти адсорбсияи РНК баста мешавад (ниг. ба қадами 6).Мо ба шумо тавсия медиҳем, ки ҳангоми ҷабидани ин супернатант бодиққатона ҷаббида нашавед.

3. Миқдори ибтидоии намуна аз ҳад зиёд аст.

Истифодаи аз ҳад зиёди намуна боиси порашавии нопурраи намуна ё лизиси нопурраи ҳуҷайра аз ҷониби Buffer PSL1 мегардад, ки дар натиҷа сутуни тозакунӣ ҳангоми тозакунӣ баста мешавад.Маҷмӯаи изолятсияи умумии РНК-и растанӣ Ҳар як намунаи коркарди тозашуда 50 мг аст.Барои намунаҳои растаниҳои полисахаридҳои полиол, мо тавсия медиҳем, ки маҷмӯаи изолятсияи Plant Total RNA PLUS -ро санҷед.

4. Ҳарорати центрифуга хеле паст аст.

Тамоми раванди ҷудокунӣ ва тозакунии РНК дар ҳарорати хонагӣ (20-25°C), магар он ки бофтаи намуна бо нитрогени моеъ шикаста мешавад. Ҳарорати баъзе центрифугаҳои криогенӣ аз 20 пасттар аст.℃, ки метавонад ба бастани сутуни тозакунии ДНК ва/ё танҳо сутуни RNA оварда расонад.Агар ин тавр шавад, ҳарорати центрифугаро ба 20-25 муқаррар кунед℃, вабоварӣ ҳосил кунед, ки омехтаи лизис ва/ё супернатант бо этанол иловашуда то 37 дараҷа гарм карда шудааст.°C.

Ягон РНК истихроҷ карда нашудааст ё ҳосили РНК паст нест

Одатан омилҳои зиёде мавҷуданд, ки ба самаранокии барқарорсозӣ таъсир мерасонанд, ба монанди: мундариҷаи намунаи РНК, усули кор, ҳаҷми элюсия ва ғайра.

Таҳлили сабабҳои умумӣ ба таври зерин:

1.Дар давоми амалиёт ваннаи ях ё центрифугаи ҳарорати паст (4°C) анҷом дода шуд.

Пешниҳод: Дар ҳарорати хонагӣ кор кунед (15-25°В) дар тамоми раванд ваннаи ях ва центрифугаи ҳарорати пастро анҷом надиҳед.

2.РНК аз сабаби нигоҳдории нодурусти намуна ё нигоҳдории дарозмуддати намуна вайрон шудааст.

Тавсия: Намунаҳои нав ҷамъовардашуда бояд зуд дар нитрогени моеъ ях карда шаванд ва сипас дар -80 ° C барои муддати тӯлонӣ нигоҳ дошта шаванд, аз яхкунӣ ва обшавии такрории намунаҳо пешгирӣ кунед;ё фавран намунаҳоро дар маҳлули RNA stabilizer RNAlater тар кунед (намунаҳои ҳайвонот).

3.Фрагментатсияи нокифояи намуна ва лизис ба бастани сутуни тозакунӣ оварда мерасонад.

Пешниҳод: Ҳангоми дастос кардани матоъ, лутфан боварӣ ҳосил кунед, ки матоъ ба қадри кофӣ хок карда шудааст ва онро зуд ба буфери PSL1 пешакӣ омодашуда интиқол диҳед (тасдиқ кунед, ки таносуби дурусти β-ME илова карда шудааст, ба қадами 1-уми расм нигаред).

4. Элюент нодуруст илова карда шудааст.

Пешниҳод: Боварӣ ҳосил кунед, ки RNase-Free ddH2O ба мобайни мембранаи сутуни тозакунӣ рехта мешавад.

5. Ҳаҷми дурусти этаноли мутлақ ба Buffer PSL2 ё Buffer PRW2 илова карда нашудааст.

Пешниҳод: Лутфан дастурҳоро иҷро кунед, ҳаҷми дурусти этаноли мутлақро ба Buffer PSL2 ва Buffer PRW2 илова кунед ва пеш аз истифода бурдани маҷмӯа хуб омехта кунед.

6. Миқдори намунаи матоъ номувофиқ аст.

Пешниҳод: 50 мг матоъро барои 500 мкл буфери PSL1 истифода баред.Истифодаи аз ҳад зиёди бофта миқдори РНК-и истихроҷшударо кам мекунад ва тозагии РНК-и ҳосилшуда низ коҳиш меёбад.Мо ба таври қатъӣ тавсия медиҳем, ки миқдори ибтидоии намуна набояд аз 50 мг дар як амалиёти истихроҷи РНК зиёд бошад.

7. Ҳаҷми элюсияи номуносиб ё элюсияи нопурра.

Пешниҳод: Ҳаҷми элюенти сутуни тозакунӣ 50-200 мкл;агар таъсири элюсия қаноатбахш набошад, тавсия дода мешавад, ки вақтро дар ҳарорати хонагӣ пас аз илова кардани RNase-Free ddH2O пешакӣ гармшуда дароз кунед, масалан 5-10 дақиқа.

8.Сутуни тозакунӣ пас аз шустан бо BufferPRW2 боқимондаи этанол дорад.

Пешниҳод: Агар найчаи холӣ барои 1 дақиқа сентрифуга карда шавад ва пас аз шустан дар буфери PRW2 то ҳол этанол боқӣ монда бошад, шумо метавонед вақти центрифугакунии найчаи холиро то 2 дақиқа зиёд кунед ё сутуни тозакуниро дар ҳарорати хонагӣ барои 5 дақиқа ҷойгир кунед, то ки боқимондаи этанол пурра тоза карда шавад.

9.Маҷмӯа нодуруст истифода шудааст.

Пешниҳод: Барои намунаҳои растаниҳои полисахаридҳои полифенолӣ, бо истифода аз маҷмӯаҳои умумӣ ба монанди маҷмӯаи изолятсияи растанӣ RNA наметавонанд намунаҳои идеалии РНК гиранд.Мо ба шумо тавсия медиҳем, ки Plant Total RNA IsolationKit Plus, ки махсус барои намунаҳои растаниҳои полисахаридҳои полифенолӣ тарҳрезӣ шудааст, истифода баред.Маҷмӯае, ки махсус барои истихроҷи РНК аз намунаҳои растаниҳои полифенол ва полисахарид таҳия шудааст.

Арзиши OD260/OD280 паст аст

Элюсияи РНК бо ddH2O ва барои хондани спектрофотометр истифода мешавад, боиси паст шудани арзишҳои OD260/OD280 мегардад.Мо тавсия медиҳем, ки 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 (ба ҷои RNase-Free ddH2O барои элиюи РНК) барои ба даст овардани арзишҳои нисбатан дурусти OD260/OD280, нигаред ба "Таҳлилҳои консентратсияи РНК ва тозакунӣ" дар саҳифаи 19.

РНК-и тозашуда вайрон мешавад

Сифати РНК-и тозашуда бо омилҳо ба монанди нигоҳдории намуна, ифлосшавии RNase ва манипуляция алоқаманд аст.

Таҳлили сабабҳои умумӣ:

1.Намунаҳои бофтаҳо дар вақти ҷамъоварӣ нигоҳ дошта намешаванд.

Тавсия: Агар намунаҳои бофтаҳо пас аз ҷамъоварӣ сари вақт истифода нашаванд, лутфан онҳоро фавран дар нитрогени моеъ дар ҳарорати паст нигоҳ доред ё пас аз яхкунии зуд дар нитрогени моеъ онҳоро ба -80°C барои нигоҳдории дарозмуддат интиқол диҳед ё фавран намунаҳоро ба маҳлули RNA stabilizer RNAlater гузоред (намунаҳои ҳайвонот).Барои истихроҷи РНК кӯшиш кунед, ки намунаҳои бофтаи тоза ҷамъшударо истифода баред.

2.Яхкунї ва обшавии такрории намунањои матоъ.

Пешниҳод: Ҳангоми нигоҳ доштани намунаҳои матоъ, беҳтар аст, ки онҳоро ба қисмҳои хурд барои нигоҳдорӣ бурида, як қисми онҳоро ҳангоми истифода бурдан аз таназзули РНК дар натиҷаи яхкунӣ ва обшавии такрории намунаҳо пешгирӣ кунед.

3.RNase дар ҳуҷраи ҷарроҳӣ ҷорӣ карда мешавад ё дастпӯшакҳои якдафъаина, ниқобҳо ва ғ.

Пешниҳод: Таҷрибаҳои истихроҷи РНК беҳтарин дар амалиёти ҷудогонаи РНК анҷом дода мешаванд ва мизи лабораториро пеш аз таҷриба тоза кардан лозим аст ва ҳангоми озмоиш дастпӯшакҳо ва ниқобҳои якдафъаина бояд пӯшида шаванд, то аз таназзули РНК дар натиҷаи ворид кардани RNase то ҳадди аксар пешгирӣ карда шавад.

4.Дар реагент ҳангоми истифода бо RNase олуда шудааст.

Пешниҳод: Бо силсилаи нави маҷмӯаҳои истихроҷи RNA-и растанӣ барои таҷрибаҳои алоқаманд иваз кунед.

5.Нубурҳои центрифуга ва нӯги пипеткаҳое, ки барои коркарди РНК истифода мешаванд, бо RNase олуда шудаанд.

Пешниҳод: Боварӣ ҳосил кунед, ки қубурҳои центрифуга, нӯги пипеткаҳо, пипеткаҳо ва ғ., ки дар истихроҷи РНК истифода мешаванд, ҳама аз RNase озоданд.

Дастурҳои дастурӣ:

Дастури дастурии маҷмӯаи изолятсияи RNA Total Plant Plus