Арзиши Ct муҳимтарин шакли пешниҳоди натиҷа дар ПЗР-и миқдорӣ флуоресцентӣ мебошад.Он барои ҳисоб кардани фарқиятҳои ифодаи ген ё рақами нусхаи ген истифода мешавад.Пас, чӣ гуна арзиши Ct миқдорбандии флуорессенсия оқилона ҳисобида мешавад?Чӣ тавр диапазони самараноки арзиши Ct-ро таъмин кардан мумкин аст?

Арзиши Ct чист?
Дар ҷараёни пурзӯркунии qPCR, шумораи мувофиқи давраҳои пурқувват (Сикл) вақте ки сигнали флуорессенси маҳсулоти пурқувватшуда ба ҳадди муқарраршудаи флуорессенсия мерасад.C барои Cycle ва T барои остона аст.Оддӣ карда гӯем, арзиши Ct ин шумораи давраҳое мебошад, ки ба он вақте ки амплификацияи ибтидоии шаблон ба миқдори муайяни маҳсулот дар qPCR мерасад, мувофиқ аст.Ба ном «микдори муайяни махсулот» баъдтар шарх дода мешавад.

Арзиши Ct чӣ кор мекунад?

1.Муносибат байни амплификацияи экспоненсиалӣ, маблағи қолаб ва арзиши Ct
Идеалӣ, генҳо дар qPCR пас аз шумораи муайяни давраҳо тавассути амплификацияи экспоненсиалӣ ҷамъ мешаванд.Муносибати байни шумораи давраҳои пурқувваткунӣ ва миқдори маҳсулот ин аст: Маблағи пурқувватшудаи маҳсулот = маблағи қолаби ибтидоӣ × (1+En) рақами давраҳо.Аммо, реаксияи qPCR на ҳамеша дар вазъияти идеалӣ аст.Ҳангоме ки миқдори маҳсулоти пурқувватшуда ба "миқдори муайяни маҳсулот" мерасад, шумораи давраҳо дар ин вақт арзиши Ct аст ва он дар давраи экспоненсиалии пурқувват аст.Муносибати байни арзиши Ct ва маблағи қолаби ибтидоӣ: Байни арзиши Ct-и қолаб ва логарифми рақами нусхаи ибтидоии қолаб муносибати хатӣ вуҷуд дорад.Чӣ қадаре ки консентратсияи ибтидоии шаблон баланд бошад, арзиши Ct ҳамон қадар хурдтар мешавад;камтар консентратсияи Шаблон ибтидоӣ, калонтар арзиши Ct.

2.Каҷи амплификация, ҳадди флуорессенсия ва миқдори муайяни маҳсулоти PCR
Миқдори маҳсулоти пурқувваткунандаи qPCR мустақиман дар шакли сигнали флуоресцентӣ, яъне хати каҷи тақвият дода мешавад.Дар марҳилаи аввали ПЗР, амплификация дар шароити идеалӣ сурат мегирад, шумораи давраҳо кам аст, ҷамъшавии маҳсулот кам аст ва сатҳи флуоресцентро аз заминаи флуоресцентӣ равшан фарқ кардан мумкин нест.Баъд аз ин, флуоресцентсия зиёд шуда, ба марҳилаи экспоненсиалӣ ворид мешавад.Миқдори маҳсулоти ПТР-ро дар як нуқтаи муайян муайян кардан мумкин аст, вақте ки реаксияи PCR танҳо дар марҳилаи экспоненсиалӣ аст, ки онро метавон ҳамчун "миқдори муайяни маҳсулот" истифода бурд ва аз ин мазмуни ибтидоии қолабро метавон муайян кард.Аз ин рӯ, шиддатнокии сигнали флуоресцентӣ, ки ба миқдори муайяни маҳсулот мувофиқ аст, ҳадди флуорессенсия мебошад.

Дар марҳилаи охири ПЗР, каҷи пурқувваткунӣ дигар амплификацияи экспоненсиалиро нишон намедиҳад ва ба марҳилаи хатӣ ва плато дохил мешавад.

3.Reproducibility арзишҳои Ct
Вақте ки давраи PCR ба рақами даврии арзиши Ct мерасад, он нав ба давраи амплификацияи экспоненсиалии ҳақиқӣ ворид шудааст.Дар айни замон, хатои хурд пурзӯр карда нашудааст, бинобар ин такроршавандагии арзиши Ct аъло аст, яъне як қолаб дар вақтҳои гуногун ё дар найҳои гуногун дар як вақт пурзӯр карда мешавад.Амплификация, арзиши Ct бадастомада доимӣ аст.

1.Самаранокии амплификация En
Самаранокии тақвияти PCR ба самаранокӣ дахл дорад, ки бо он полимераз генро ба ампликон табдил медиҳад.Самаранокии амплификация ҳангоми табдил додани як молекулаи ДНК ба ду молекулаи ДНК 100% аст.Самаранокии амплификация одатан ҳамчун En ифода карда мешавад.Барои осон кардани таҳлили мақолаҳои минбаъда, омилҳое, ки ба самаранокии пурқувват таъсир мерасонанд, мухтасар оварда шудаанд.

2. Диапазони арзишҳои Ct
Арзишҳои Ct аз 15 то 35 мебошанд.Агар арзиши Ct камтар аз 15 бошад, он ба ҳисоб меравад, ки амплификация дар доираи давраи ибтидоӣ аст ва ба ҳадди флуорессенсия расида нашудааст.Идеалӣ, байни арзиши Ct ва логарифми рақами нусхаи ибтидоии қолаб, яъне каҷи стандартӣ муносибати хатӣ вуҷуд дорад.Тавассути каҷи стандартӣ, вақте ки самаранокии амплификация 100% аст, арзиши ҳисобшудаи Ct барои миқдори рақами як нусхаи ген тақрибан 35 аст. Агар он аз 35 зиёд бошад, рақами нусхаи ибтидоии қолаб аз ҷиҳати назариявӣ камтар аз 1 аст, ки онро бемаънӣ ҳисоб кардан мумкин аст.

Барои диапазонҳои гуногуни генҳои Ct, аз сабаби фарқияти рақами нусхаи ген ва самаранокии амплификация дар миқдори аввалияи қолаб, бояд каҷи стандартии ген ва ҳисоб кардани диапазони муайянкунии хаттии генро анҷом дод.

3.Омилҳои таъсирбахши арзиши Ct
Аз муносибати байни шумораи давраҳои пурқувваткунӣ ва миқдори маҳсулот: миқдори маҳсулоти пурқувватшуда = миқдори қолаби ибтидоӣ × (1+En) рақами давра, дидан мумкин аст, ки дар шароити идеалӣ миқдори қолаби ибтидоӣ ва En ба арзиши Ct таъсири манфӣ мерасонад.Тафовут дар сифати қолаб ё самаранокии пурқувват боиси он мегардад, ки арзиши Ct хеле калон ё хеле хурд бошад.

4.Ct арзиши хеле калон ё хеле хурд аст