Барраси
Муайянкунии босуръати растаниҳои трансгенӣ
Матн/Тонг Ючэнг
Амалиёти таҷрибавӣ/Han Ying
Муҳаррир/Вен Юҷун
Калимаҳо / 1600+
Вақти тавсияшудаи хониш / 8-10 дақиқа
Муайянкунии босуръати растаниҳои трансгенӣ
Ҳамчун як навкор дар лаборатория, аз як хӯшаи растаниҳои дорои суръати пасти табдил додани растаниҳои мусбӣ кори хуб нест.Аввалан, ДНК бояд аз миқдори зиёди намунаҳо як ба як истихроҷ карда шавад ва сипас генҳои хориҷӣ тавассути PCR муайян карда мешаванд.Бо вуҷуди ин, натиҷаҳо аксар вақт холӣ ва бандҳо бо якчанд ҷузъҳо мебошанд, аммо муайян кардан ғайриимкон аст, ки оё кашфиётҳои гумшуда ё ошкоркунии бардурӯғ вуҷуд доранд..Оё бо чунин раванд ва натиҷаҳои таҷрибавӣ рӯ ба рӯ шудан хеле нотавон аст?Парво накунед, бародар ба шумо тарзи скрининги растаниҳои трансгении мусбатро осон ва дақиқ таълим медиҳад.
Қадами 1: Примерҳои муайянкунии тарҳрезӣ
Генҳои эндогенӣ ва гени экзогениро, ки мувофиқи намунаи санҷидашаванда муайян карда мешаванд, муайян кунед ва пайдарпаии намояндагии 100-500bp-ро дар ген барои тарҳрезии ибтидоӣ интихоб кунед.Примерҳои хуб метавонанд дақиқии натиҷаҳои ошкорро таъмин кунанд ва вақти муайянкуниро кӯтоҳ кунанд (ниг.
Шарҳ:
Примерҳои нав тарҳрезишуда бояд пеш аз анҷом додани кашфи миқёси калон шароити реаксияро оптимизатсия кунанд ва дақиқӣ, дақиқӣ ва лимити кашфи онро тафтиш кунанд.
Қадами 2:Таҳияи протоколи таҷрибавӣ
Назорати мусбӣ: ДНК-и тозашудаи дорои порчаи ҳадафро ҳамчун қолаб истифода баред, то муайян кунед, ки оё системаи реаксияи ПТР ва шароитҳо муқаррарӣ ҳастанд.
Назорати манфӣ/холӣ: Шаблони ДНК ё ddH -ро истифода баред2O, ки порчаи мавриди ҳадафро ҳамчун қолаб барои муайян кардани мавҷудияти манбаи ифлосшавӣ дар системаи PCR дар бар намегирад.
Назорати истинодҳои дохилӣ: омезиши ибтидоӣ/зонди гени эндогении намунаро барои санҷида истифода баред, то ки оё қолабро тавассути PCR муайян кардан мумкин аст ё на.
Шарҳ:
Барои ҳар як санҷиш барои арзёбии дурустии натиҷаҳои таҷрибавӣ бояд назорати мусбӣ, манфӣ/блокӣ ва назорати дохилӣ муқаррар карда шавад.
Қадами 3: Тайёр кардани таҷриба
Пеш аз истифода, мушоҳида кунед, ки маҳлул баробар омехта шудааст ё не.Агар боришот пайдо шавад, пеш аз истифода онро мувофиқи дастурҳо ҳал ва омехта кардан лозим аст.Омехтаи 2×PCR бояд пеш аз истифода пипета карда шавад ва такроран бо микропипета омехта карда шавад, то тақсимоти нобаробари ионҳоро пешгирӣ кунад.
Шарҳ:
Дастурҳоро бароред ва онҳоро бодиққат хонед ва пеш аз таҷриба тайёриро қатъиян мувофиқи дастурҳо бинед.
Қадами 4: Омода кардани системаи реаксияи PCR
Тибқи протоколи таҷрибавӣ, праймерҳоро омехта кунед, H2O, 2×PCR омехта, центрифуга кунед ва онҳоро ба ҳар як найчаи реаксия тақсим кунед.
Шарҳ:
Барои санҷиши миқёси калон ё дарозмуддат тавсия дода мешавад, ки системаи реаксияи PCR дорои ферментҳои UNG мебошад, ки метавонад ифлосшавии аэрозолро, ки аз маҳсулоти ПТР ба вуҷуд омадааст, пешгирӣ кунад.
Қадами 5: Шаблон реаксияро илова кунед
Бо истифода аз технологияи PCR Direct, ба раванди тозакунии кислотаи нуклеинӣ лозим нест.Шаблонро метавон дар давоми 10 дақиқа омода кард ва ба системаи реаксияи PCR мувофиқ илова кард.
Шарҳ:
Усули Lysis таъсири беҳтари муайянкунанда дорад ва маҳсулоти бадастомада метавонад барои реаксияҳои муайянкунии сершумор истифода шавад.
5.1: PCR мустақими баргҳо
Мувофики андозаи расми дар дастур додашуда бофтаи барги диаметраш 2-3мм бурида, дар системаи реаксияи ПТР ҷойгир кунед.
Эзоҳ: Боварӣ ҳосил кунед, ки пораҳои баргҳо пурра дар маҳлули реаксияи PCR ғарқ шудаанд ва бофтаи баргҳои аз ҳад зиёд илова накунед.
5.2: Усули лизи барг
Бофтаи баргро бо диаметраш 5—7 мм бурида, ба найчаи центрифуга гузоред.Агар шумо баргҳои баркамолро интихоб кунед, лутфан аз истифодаи бофтаҳои рагҳои асосии барг худдорӣ кунед.Лизати 50ul Buffer P1-ро пипетка ба найчаи центрифуга резед, то боварӣ ҳосил кунед, ки лизат метавонад бофтаи баргро пурра ғарқ кунад, онро дар циклери термикӣ ё ваннаи металлӣ ҷойгир кунед ва дар ҳарорати 95 ° C барои 5-10 дақиқа лиза кунед.
Маҳлули безараргардонии 50ul Buffer P2 илова кунед ва хуб омехта кунед.Лизати ҳосилшуда метавонад ҳамчун қолаб истифода шавад ва ба системаи реаксияи PCR илова карда шавад.
Эзоҳ: Миқдори қолаб бояд дар байни 5-10% аз системаи PCR бошад ва набояд аз 20% зиёд бошад (масалан, дар системаи PCR 20μl, 1-2μl буфери лизис илова кунед, на бештар аз 4μl).
Қадами 6: Реаксияи PCR
Пас аз центрифуга кардани найчаи реаксияи ПЗР, онҳоро дар асбоби ПТР барои пурқувваткунӣ ҷойгир кунед.
Шарҳ:
Реаксия барои амплификатсия қолаби тозанашударо истифода мебарад, бинобар ин шумораи давраҳои пурқувваткунӣ нисбат ба истифодаи қолаби тозашудаи ДНК 5-10 давра зиёд аст.
Қадами 7: Муайян кардани электрофорез ва таҳлили натиҷа
M: 100bp нардбони ДНК
1\4: Усули тозашудаи ДНК
2\5: Усули бевоситаи PCR
3\6: Назорати холӣ
Назорати сифат:
Натиҷаҳои санҷиши асбобҳои гуногуни назорати дар таҷриба муқарраршуда бояд ба шартҳои зерин ҷавобгӯ бошанд.Дар акси ҳол, бояд сабаби мушкилот таҳлил карда шавад ва пас аз бартараф кардани мушкилот, санҷиш бояд дубора анҷом дода шавад.
Ҷадвали 1. Натиҷаҳои санҷиши муқаррарии гурӯҳҳои гуногуни назоратӣ
* Вақте ки плазмид ҳамчун назорати мусбӣ истифода мешавад, натиҷаи санҷиши генҳои эндогенӣ метавонад манфӣ бошад
Натиҷаи ҳукм:
A. Натиҷаи санҷиши гени эндогении намуна манфӣ аст, ки ин нишон медиҳад, ки ДНК-и барои муайянкунии оддии ПТР мувофиқ аз намуна гирифта намешавад ё ДНК-и истихроҷшуда дорои ингибиторҳои реаксияи ПТР мебошад ва ДНК бояд дубора истихроҷ карда шавад.
B. Натиҷаи санҷиши гени эндогении намуна мусбат аст ва натиҷаи санҷиши гени экзогенӣ манфӣ аст, ки нишон медиҳад, ки ДНК барои муайянкунии оддии PCR аз намуна истихроҷ карда мешавад ва метавон ҳукм кард, ки гени XXX дар намуна ошкор нашудааст.
C. Натиҷаи санҷиши гени эндогении намуна мусбат аст ва натиҷаи санҷиши гени экзогенӣ мусбӣ аст, ки аз он шаҳодат медиҳад, ки ДНК-и барои ташхиси оддии ПТР мувофиқ аз намуна истихроҷ шудааст ва ДНК-и намуна гени XXX дорад.Таҷрибаҳои тасдиқкуниро метавон минбаъд анҷом дод.
Қадами 8: Примерҳои муайянкунии тарҳрезӣ
Пас аз таҷриба, маҳлули 2% гипохлориди натрий ва маҳлули 70% этанолро барои тоза кардани майдони таҷрибавӣ барои пешгирии ифлосшавии муҳити зист истифода баред.
Замима
Љадвали 2. Примерњои маъмулан истифодашаванда барои муайянкунии умумии ПЗР растаниҳои аз ҷиҳати генетикӣ тағйирёфта
Ҳуҷҷати истинод:
SN/T 1202-2010, Усули муайянкунии сифатии ПТР барои компонентҳои аз ҷиҳати генетикӣ тағйирёфтаи растанӣ дар ғизо.
Эълони Вазорати кишоварзии 1485-5-2010, Санҷиши компонентҳои растаниҳои аз ҷиҳати генетикӣ тағйирёфта ва маҳсулоти онҳо - биринҷ M12 ва ҳосилаҳои он.
Вақти фиристодан: июн-09-2021
