• PCR як усулест, ки барои тақвият додани ДНК аз миқдори ками қолаби ДНК истифода мешавад.RT-PCR транскрипсияи баръаксро барои тавлиди қолаби ДНК аз манбаи РНК истифода мебарад, ки пас аз он тақвият дода мешавад.
• PCR ва RT-PCR маъмулан реаксияҳои нуқтаи ниҳоӣ мебошанд, дар ҳоле ки qPCR ва RT-qPCR кинетикаи суръати синтези маҳсулотро ҳангоми реаксияи PCR барои муайян кардани миқдори қолаби мавҷуда истифода мебаранд.
• Усулҳои навтар, ба монанди PCR рақамӣ, миқдори мутлақи қолаби ибтидоии ДНК-ро таъмин мекунанд, дар ҳоле ки усулҳо ба монанди PCR изотермикӣ ниёз ба таҷҳизоти гаронарзишро барои таъмини натиҷаҳои боэътимод коҳиш медиҳанд.

Реаксияи занҷири полимеразӣ (PCR) як усули нисбатан содда ва васеъ истифодашавандаи биологияи молекулавӣ барои тақвият ва ошкор кардани пайдарпаии ДНК ва РНК мебошад.Дар муқоиса бо усулҳои анъанавии клонизатсия ва амплификацияи ДНК, ки аксар вақт метавонад рӯзҳоро дар бар гирад, PCR танҳо чанд соатро талаб мекунад.PCR хеле ҳассос аст ва барои ошкор ва тақвият додани пайдарпайии мушаххас шаблони ҳадди ақалро талаб мекунад.Усулҳои асосии ПТР аз муайянкунии оддии ДНК ва РНК боз ҳам пешрафта шудаанд.Дар зер, мо шарҳи усулҳои гуногуни PCR ва реактивҳоеро, ки мо дар Enzo Life Sciences барои эҳтиёҷоти тадқиқотии шумо пешкаш мекунем, пешниҳод кардем.Мо мақсад дорем, ки ба олимон дар дастрасии зуд ба реагентҳои PCR барои истифода дар лоиҳаи тадқиқотии навбатии худ кӯмак расонем!

PCR

Барои PCR стандартӣ, ба шумо танҳо як полимеразаи ДНК, магний, нуклеотидҳо, праймерҳо, қолаби ДНК, ки тақвият дода мешавад ва термоцикл лозим аст.Механизми ПТР ба мисли ҳадафаш содда аст: 1) ДНК-и дуқабата (dsDNA) гармӣ денатурат карда мешавад, 2) праймерҳо ба риштаҳои ягонаи ДНК рост меоянд ва 3) праймерҳо тавассути полимеразаи ДНК дароз карда мешаванд, ки дар натиҷа ду нусхаи ДНК ба вуҷуд меояд. риштаи аслии ДНК.Раванди денатуратсия, гармшавӣ ва дарозшавӣ дар як қатор ҳароратҳо ва вақтҳо ҳамчун як давраи пурқувватшавӣ маълум аст (расми 1).

Ҳар як қадами давра бояд барои қолаб ва маҷмӯи ибтидоии истифодашуда оптимизатсия карда шавад.Ин давра тақрибан 20-40 маротиба такрор карда мешавад ва маҳсулоти пурқувватшударо баъдан одатан тавассути гели агарозӣ таҳлил кардан мумкин аст (расми 2).

Азбаски PCR усули хеле ҳассос аст ва барои реаксияҳои якхела ҳаҷми хеле хурд лозим аст, омода кардани омехтаи мастер барои якчанд реаксия тавсия дода мешавад.Омехтаи асосӣ бояд хуб омехта карда шавад ва сипас аз рӯи шумораи реаксияҳо тақсим карда шавад, то ки ҳар як реаксия миқдори якхелаи фермент, dNTPs ва праймерҳоро дар бар гирад.Бисёре аз таъминкунандагон, ба монанди Enzo Life Sciences, инчунин омехтаҳои PCR-ро пешниҳод мекунанд, ки аллакай ҳама чизро ба истиснои праймерҳо ва қолаби ДНК дар бар мегиранд.

Минтақаҳои аз гуанин/ситозин бой (GC бой) дар усулҳои стандартии PCR мушкилотро нишон медиҳанд.пайдарпаии аз GC бой устувортар аз пайдарпаии бо мазмуни GC камтар.Ғайр аз он, пайдарпаии бой аз GC майл доранд сохторҳои дуюмдараҷа, ба монанди ҳалқаҳои мӯй.Дар натиҷа, дар марҳилаи денатурататсия пурра ҷудо кардани риштаҳои дукаратаи аз GC бой душвор аст.Аз ин рӯ, полимеразаи ДНК наметавонад риштаи навро бидуни монеа синтез кунад.Ҳарорати баландтари денатуратсия метавонад инро беҳтар кунад ва тасҳеҳҳо ба ҳарорати баландтари гармкунӣ ва вақти кӯтоҳтар метавонад пайвастшавии ғайримуқаррарии праймерҳои дорои GC-ро пешгирӣ кунад.Реагентҳои иловагӣ метавонанд тақвияти пайдарпаии бойи GC-ро тақвият бахшанд.DMSO, глицерин ва бетаин барои вайрон кардани сохторҳои дуюмдараҷа, ки аз таъсири мутақобилаи GC ба вуҷуд меоянд, кӯмак мекунанд ва ба ин васила ҷудошавии риштаҳои дукаратаро осон мекунанд.

Hot Start PCR

Амплификатсияи ғайримуқаррарӣ мушкилотест, ки метавонад ҳангоми PCR рух диҳад.Аксарияти полимеразҳои ДНК, ки барои PCR истифода мешаванд, дар ҳарорати аз 68 ° C то 72 ° C беҳтар кор мекунанд.Аммо, фермент метавонад дар ҳарорати пасттар, гарчанде ки то дараҷае пасттар бошад, фаъол бошад.Дар ҳарорати хеле пасттар аз ҳарорати гармкунӣ, праймерҳо метавонанд ба таври ғайримуқаррарӣ пайваст шаванд ва ба пурқувватшавии ғайримуқаррарӣ оварда расонанд, ҳатто агар реаксия дар ях муқаррар карда шавад.Инро бо истифода аз ингибиторҳои полимераз, ки танҳо пас аз расидан ба ҳарорати муайян аз полимеразҳои ДНК ҷудо мешаванд, пешгирӣ кардан мумкин аст, аз ин рӯ истилоҳи гарми PCR мебошад.Ингибитор метавонад як антитело бошад, ки полимеразаро мепайвандад ва дар ҳарорати ибтидоии денатуратсия (одатан 95°С) денатурат мекунад.

Полимерази баландсифат

Дар ҳоле ки полимеразҳои ДНК ба пайдарпаии қолаби аслӣ хеле дақиқ афзоиш меёбанд, хатогиҳо дар мувофиқати нуклеотидҳо метавонанд рух диҳанд.Носозгорӣ дар замимаҳо, ба монанди клонкунӣ метавонад ба транскриптҳои буридашуда ва сафедаҳои нодуруст тарҷумашуда ё ғайрифаъол дар поён оварда расонад.Барои роҳ надодан ба ин номувофиқиятҳо, полимеразҳо бо фаъолияти "корҷӯӣ" муайян ва ба ҷараёни кор дохил карда шудаанд.Аввалин полимерази корректор, Pfu, соли 1991 дар Pyrococcus furiosus муайян карда шудааст.Ин фермент Pfu дорои фаъолияти экзонуклеаза аз 3' то 5' мебошад.Вақте ки ДНК афзоиш меёбад, экзонуклеаза нуклеотидҳои номувофиқро дар 3' охири ришта хориҷ мекунад.Пас аз он нуклеотиди дуруст иваз карда мешавад ва синтези ДНК идома дорад.Муайян кардани пайдарпаии нодурусти нуклеотидҳо ба наздикии ҳатмӣ барои трифосфати нуклеозидҳои дуруст бо фермент асос ёфтааст, ки дар он пайвастагии бесамар синтезро суст мекунад ва барои иваз кардани дуруст имкон медиҳад.Фаъолияти таҳрири полимерази Pfu боиси хатогиҳои камтар дар пайдарпаии ниҳоӣ дар муқоиса бо полимераза Так ДНК мегардад.Дар солҳои охир, дигар ферментҳои таҳриркунанда муайян карда шуданд ва тағиротҳои ферментҳои аслии Pfu барои боз ҳам кам кардани сатҳи хатогӣ ҳангоми амплификацияи ДНК анҷом дода шуданд.

RT-PCR

ПТР транскрипсияи баръакс ё RT-PCR имкон медиҳад, ки РНК ҳамчун қолаб истифода шавад.Қадами иловагӣ имкон медиҳад, ки РНК ошкор ва тақвият дода шавад.РНК баръакс ба ДНК комплементарӣ (cDNA) бо истифода аз транскриптазаи баръакс транскрипт карда мешавад.Сифат ва тозагии қолаби RNA барои муваффақияти RT-PCR муҳим аст.Қадами аввалини RT-PCR ин синтези гибриди ДНК/РНК мебошад.Транскриптазаи баръакс инчунин функсияи RNase H дорад, ки қисми RNA-и гибридро таназзул мекунад.Молекулаи якқатораи ДНК баъдан бо фаъолияти полимеразаи аз ДНК вобастаи транскриптазаи баръакс ба cDNA анҷом меёбад.Самаранокии реаксияи риштаи якум метавонад ба раванди амплификация таъсир расонад.Аз ин ҷо, тартиби стандартии PCR барои тақвият додани cDNA истифода мешавад.Имконияти баргардонидани РНК ба cDNA тавассути RT-PCR бартариҳои зиёд дорад ва он пеш аз ҳама барои таҳлили ифодаи генҳо истифода мешавад.РНК якқатор ва хеле ноустувор аст, ки бо он кор кардан душвор аст.Он одатан ҳамчун қадами аввал дар qPCR хизмат мекунад, ки миқдори транскриптҳои РНК-ро дар намунаи биологӣ муайян мекунад.

qPCR ва RT-qPCR

PCR-и миқдорӣ (qPCR) барои ошкор, тавсиф ва миқдори кислотаҳои нуклеинӣ барои барномаҳои сершумор истифода мешавад.Дар RT-qPCR, транскриптҳои РНК аксар вақт тавассути транскрипсияи баръакси онҳо ба cDNA, тавре ки дар боло тавсиф шудааст, муайян карда мешаванд ва баъдан qPCR анҷом дода мешавад.Тавре ки дар ПТР стандартӣ, ДНК бо се марҳилаи такрорӣ тақвият дода мешавад: денатуратсия, гармкунӣ ва дарозкунӣ.Аммо, дар qPCR, тамғагузории флуоресцентӣ имкон медиҳад, ки ҳангоми пешрафти PCR маълумот ҷамъоварӣ карда шавад.Ин техника аз сабаби як қатор усулҳо ва химияҳои мавҷуда манфиатҳои зиёд дорад.

Дар qPCR-и ба ранг асосёфта (одатан сабз), тамғагузории флуоресцентӣ имкон медиҳад, ки миқдори молекулаҳои пурқувватшудаи ДНК тавассути истифодаи ранги ҳатмии dsDNA муайян карда шавад.Дар давоми ҳар як давра флуоресцентсия чен карда мешавад.Сигнали флуоресцентӣ мутаносибан ба миқдори ДНК репликашуда меафзояд.Аз ин рӯ, ДНК дар «вақти воқеӣ» миқдори муайян карда мешавад (расми 3).Камбудиҳои qPCR дар асоси ранг дар он аст, ки дар як вақт танҳо як ҳадаф тафтиш карда мешавад ва ранг ба ҳама гуна ds-DNA-и дар намуна мавҷудбуда мепайвандад.

Дар qPCR-и ба зонд асосёфта, дар ҳар як намуна ҳамзамон ҳадафҳои зиёдеро муайян кардан мумкин аст, аммо ин оптимизатсия ва тарҳрезии зонд(ҳо)-и мушаххаси ҳадафро, ки ба ғайр аз праймерҳо истифода мешавад, талаб мекунад.Якчанд намуди тарҳҳои зондҳо мавҷуданд, аммо навъи маъмултарин зондҳои гидролизӣ мебошад, ки флюорофор ва хомӯшкунандаро дар бар мегирад.Интиқоли энергияи резонанси флуоресцентӣ (FRET) партоби флюорофорро тавассути хомӯшкунанда дар ҳоле, ки зонд солим аст, пешгирӣ мекунад.Аммо, ҳангоми реаксияи PCR, зонд ҳангоми васеъшавии праймер ва тақвияти пайдарпаии мушаххасе, ки ба он вобаста аст, гидролиз мешавад.Ҷудошавии зонд флюорофорро аз хомӯшкунанда ҷудо мекунад ва боиси афзоиши флуоресценти вобаста ба амплификация мегардад (расми 4).Ҳамин тариқ, сигнали флуоресцентӣ аз реаксияи qPCR дар асоси зонд ба миқдори пайдарпаии ҳадафи зонд, ки дар намуна мавҷуд аст, мутаносиб аст.Азбаски qPCR-и ба зонд асосёфта нисбат ба qPCR дар асоси ранг мушаххастар аст, он аксар вақт технологияест, ки дар таҳлилҳои ташхиси qPCR истифода мешавад.

Амплификацияи изотермикӣ

Технологияҳои дар боло зикршуда PCR таҷҳизоти гаронбаҳои термосиклро барои дақиқ баланд бардоштани ҳарорати камера барои қадамҳои денатуратсия, гармкунӣ ва васеъшавӣ талаб мекунанд.Як катор техникахое кор карда шудаанд, ки ба ин гуна дастгоххои дакик эхтиёч надоранд ва онхоро дар ваннаи оддии об ё хатто дар дохили хучрахои шавковар ичро кардан мумкин аст.Ин усулҳоро дар маҷмӯъ амплификацияи изотермӣ меноманд ва дар асоси тақвияти экспоненсиалӣ, хатӣ ё каскадӣ кор мекунанд.

Намуди маъруфи амплификацияи изотермикӣ ин тақвияти изотермиии ҳалқавӣ ё LAMP мебошад.LAMP амплификацияи экспоненсиалиро дар 65⁰C барои пурзӯр кардани қолаби ДНК ё РНК истифода мебарад.Ҳангоми иҷрои LAMP, аз чор то шаш праймер, ки ба минтақаҳои ДНК-и мақсаднок илова мекунанд, бо полимеразаи ДНК барои синтез кардани ДНК-и нав истифода мешаванд.Ду аз ин праймерҳо пайдарпайии иловагиро доранд, ки пайдарпаии дигар праймерҳоро эътироф мекунанд ва онҳоро мепайвандад, ки имкон медиҳад, ки дар ДНК-и нав синтезшуда сохтори "халқа" ба вуҷуд ояд, ки пас аз он ба тозакунии праймер дар давраҳои минбаъдаи амплификация мусоидат мекунад.LAMP-ро бо усулҳои гуногун дидан мумкин аст, аз ҷумла флуоресцентсия, электрофорези гели агарозӣ ё колориметрия.Осонии визуалӣ ва муайян кардани мавҷудият ё набудани маҳсулот тавассути колориметрия ва набудани таҷҳизоти гаронбаҳо LAMP-ро як варианти мувофиқ барои озмоиши SARS-CoV-2 дар минтақаҳое сохт, ки озмоиши клиникии клиникӣ дастрас набуд, ё нигоҳдорӣ ва интиқоли намунаҳо. имконнопазир буд, ё дар лабораторияҳое, ки қаблан таҷҳизоти термосиклии PCR надоштанд.