RNase як калимаи ҳассос аст, ки бисёре аз донишҷӯёне, ки аксар вақт таҷрибаҳои истихроҷи РНК мегузаронанд, шунидан намехоҳанд.РНК, ки дар ниҳоят бо реагентҳои хеле заҳролуд фенол ва хлороформ истихроҷ карда шуд, комилан мусаллаҳ шуд.Ман оштӣ надорам!!!Имрӯз биёед ба пайдоиши Rnase машҳур назар андозем.

Рибонуклеаза (RNase) ё RNase як нуклеазаест, ки метавонад РНК-ро ба молекулаҳои хурд гидролиз кунад.RNase, ҳамчун сафедаи хурди молекулавӣ, ғайриоддӣ устувор аст .Стерилизатсияи буғи муқаррарии ҳарорати баланд ва фишори баланд ва ингибиторҳои сафеда онро пурра ғайрифаъол карда наметавонанд.Устувории RNase асосан аз пайвандҳои дисульфидӣ дар сохтор ба даст меояд.Масалан, RNase-и маъмулан истифодашавандаи гадуди гов танҳо 124 аминокислотаҳо дорад, аммо дорои 4 пайванди дисульфидӣ мебошад.Пайванди сулфур ва пайванди дисульфид RNase-ро бо устувории аълои гармӣ медиҳанд.Илова бар ин, рназа вазни нисбатан хурди молекулавӣ дорад ва дар бисёр ҳолатҳо конформатсияи аслии худро зуд барқарор карда метавонад.

Илова бар он, ки хеле устувор аст,RNases дар лаборатория дар ҳама ҷо мавҷуданд .RNase як механизми муҳофизати биологӣ мебошад.Барои як ҳуҷайра, РНК-и экзогенӣ аксар вақт марговар аст.Дар муқоиса бо ДНК экзогенӣ, РНК экзогенӣ аксар вақт хатарноктар аст.РНК хушбахтона транскрипсия ва тарҷума карда мешавад, бинобар ин қариб ҳама организмҳо RNases-ро барои муҳофизат аз ҳамлаи РНК экзогенӣ таҳия кардаанд.Аз ин рӯ, ҳуҷайраҳои бактериявӣ, ки дар лаборатория парвариш карда мешаванд ва шумо, ки РНК-ро истихроҷ мекунед, бӯи RNase мебарорад.Моеъҳои бадани инсон (гилро, ашк ва ғ.) миқдори зиёди RNase доранд, бинобар ин ҳангоми таназзули РНК гиря накунед.Чӣ қадаре ки шумо гиря кунед, таназзули РНК ҳамон қадар бадтар мешавад!!Хоҳари Даию барои истихроҷи РНК мувофиқ нест!

Илова бар ин, пӯсти нозуки шумо инчунин миқдори зиёди RNase дорад ва маркерҳо, пипеткаҳо, дарҳои яхдон ва дастаки дарҳое, ки ба пӯст ламс шудаанд, инчунин RNase доранд.

Бо ин қадар ғамхорӣ, биёед бубинем, ки чӣ гуна бо RNases мубориза бурдан мумкин аст.

Аввалин чизе, ки ҳама ҳангоми хориҷ кардани РНК дар бораи он фикр мекунандDEPC(диэтил пирокарбонат).DEPC асосан протеинро бо роҳи якҷояшавӣ бо ҳалқаи имидазоли гистидини гурӯҳи фаъоли RNase денатуратсия мекунад ва ба ин васила фаъолияти ферментро бозмедорад.0,1% DEPC метавонад ба Rnase таъсири беҳтари бартарафкунӣ дошта бошад, аммо мо бояд диққат диҳем, ки DEPC канцерогени маълум аст, бинобар ин ҳангоми истифодаи он диққати махсус бояд дод.

Барои RNase, мо бояд аз ду ҷиҳат оғоз кунем,аввал ин ҷилавгирӣ аз фаъолияти RNase эндогенӣ мебошад

Реагентҳои анъанавии истихроҷи РНК, ба монанди гуанидин изотиоцианати ва DTT, ки дар Тризол мавҷуданд, метавонанд пайванди дисульфиди RNase-ро кушоянд, аммо ҳанӯз ҳам баъзе RNases вуҷуд доранд, махсусан дар намунаҳои бофтаҳо, аз ин рӯ ба ҳарорати паст диққат диҳед.

1.Намунаи матоъро пас аз гирифтани он фавран ба нитрогени моеъ ё дар маҳлули нигоҳдории RNA-и тиҷоратӣ гузоред.

2.Пас аз истихроҷи РНК-и намунаи ҳуҷайра, онро ба маҳлули лизис илова кунед ва онро дар қуттии ях лиз кунед.

3. Барои суфтан аз нитрогени моеъ истифода бурдан бехтар аст вақте ки намунаҳои бофтаҳо яксон карда мешаванд.Хангоми истифода бурдани гомогенизатори электрики бе нитроген моеъ ба пурра хунук кардани адаптери гомогенат диккат дихед.

Дуюм DNase экзогенӣ мебошад

1.Комилан мусаллах бошед, халтаҳои лабораторӣ пӯшед, ниқоб пӯшед ва ҳатман як ҷуфт дастпӯшҳои нав пӯшед (ин қадар сарфакор нашавед! Бояд қайд кард, ки Тризол аз ҳад зиёд зангзананда аст ва он инчунин тавассути дастпӯшакҳо хеле қавӣ аст, бинобар ин ба дастҳоят начакед).

2.Ҳама маслиҳатҳои пипеткаҳои истифодашуда, қубурҳои EP, қубурҳои PCR ва дигар таҷҳизот бояд аз RNase коркард карда шаванд.Онро дар 0,1% DEPC тар карда, баъд зери фишори баланд фишор додан мумкин аст.Диққат ба амалиёт дар як қуттии дуд.Золимони маҳаллӣ метавонанд мустақиман барои хориҷ кардани ферментҳо маводи истеъмолӣ харанд.

PS: Биёед ман ба шумо як усули танбалиро мегӯям.Гарчанде ки ҳарорати баланд ва фишори баланд RNase-ро пурра нест карда наметавонад, он қисми зиёди онро хориҷ мекунад.2 маротиба баланд шудани ҳарорати баланд ва фишори баланд таъсири хуб дорад ва истихроҷи РНК таъсири кам дорад.

3.Алкогол метавонад сафедаҳоро денатурат кунад,то ҷадвали истихроҷи РНК метавонад бо спирти 75% хушк карда шавад , ва дастпӯшакҳоро низ бо спирт пошидан мумкин аст.

4.Маҳлули ниҳоии ҳалкунандаи РНК ва найчаи центрифуга низ бояд де-РНаз коркард карда шавад.Оби DEPC як маҳлули ҳалкунандаи RNA маъмулан истифода мешавад.Биёед дар бораи усули дурусти тайёр кардани оби DEPC сӯҳбат кунем (дар хотир доред, ки ҳангоми харидани он DEPC-и тиҷоратиро дубора баста кунед)

DEPC-ро ба оби ултрасаф дар 1:1000 илова кунед, хуб ҷунбонда, бигзоред шабона дар 37 ° C истед ва дар 121 ° C дар ҳарорати баланд ва фишори баланд барои 15 дақиқа стерилизатсия кунед.Оби DEPC -ро дар -20 ° C дар 1 мл аликвотҳо нигоҳ доштан мумкин аст.

Ниҳоят, барои ҷамъбаст: ҳарорати паст калиди аст, маводи истеъмолӣ хуб коркард карда мешавад, пурра мусаллаҳ ва камтар гап!

Хуб, ин барои стратегияи имрӯза аст.Ба шумо тамоми консентратсияи РНК ва покии шумо, ки зикр кардед, таманно дорам.Ҳарду A260/A280 2.0 мебошанд!!!

Албатта, агар шумо aмаҷмӯи истихроҷи RNA амалиёти ҳарорати хонагӣ, шумо шояд ба мушкилоти дар боло зикршуда дучор нашавед.

Амалиёт дар ҳарорати хонагӣ, бе илова кардани DNase, дар давоми 11 дақиқа РНК-ро аз ҳуҷайраҳо ҷудо мекунад ва РНК-ро аз бофтаҳои ҳайвонот ё растаниҳо дар 30 дақиқа ҷудо мекунад.

Барои намунаҳои озмоишӣ, лутфан тамос гиред:overseas@foregene.com

Маҳсулоти марбут:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/