PCR-и миқдорӣ флуоресцентӣ (инчунин бо номи TaqMan PCR маълум аст, минбаъд FQ-PCR номида мешавад) як технологияи нави миқдорӣ кислотаи нуклеинӣ мебошад, ки аз ҷониби PE (Перкин Элмер) дар Иёлоти Муттаҳида дар соли 1995 таҳия шудааст. Ин технология ба PCR анъанавӣ тавассути илова кардани зондҳои тамғаи флюоресцентӣ асос ёфтааст.Дар муқоиса бо ПТР чандир, FQ-PCR барои амалӣ намудани вазифаи миқдории худ бартариҳои зиёд дорад.Ин мақола ният дорад ба таври мухтасар тавсиф, принсипҳо, усулҳо ва татбиқи технологияро тавсиф кунад.
1 Хусусиятҳо
FQ-PCR на танҳо ҳассосияти баланди ПЗР-и оддӣ дорад, балки аз сабаби истифодаи зондҳои флуоресцентӣ, он метавонад тағирёбии сигнали флуоресцентиро ҳангоми пурзӯркунии ПЗР тавассути системаи гузаронии фотоэлектрикӣ мустақиман муайян кунад, то натиҷаҳои миқдорӣ ба даст орад, ки ин камбудиҳои зиёди PCR-и анъанавиро бартараф мекунад, аз ин рӯ, он инчунин дорои хосиятҳои баланди технологияи ДНК ва hyctropics баланд аст.
Масалан, маҳсулоти умумии ПТР-ро тавассути электрофорези агарози гелӣ ва ранг кардани бромиди этидиум бо нури ултрабунафш ё бо роҳи электрофорези гели полиакриламидӣ ва ранг кардани нуқра мушоҳида кардан лозим аст.Ин на танҳо асбобҳои зиёдеро талаб мекунад, балки вақт ва кӯшишро низ талаб мекунад.Доғҳои бромиди Ethidium истифодашуда ба бадани инсон зараровар аст ва ин расмиёти мураккаби таҷрибавӣ барои ифлосшавӣ ва мусбатҳои бардурӯғ имконият фароҳам меорад.Бо вуҷуди ин, FQ-PCR ҳангоми боркунии намуна танҳо як маротиба бояд сарпӯшро кушояд ва раванди минбаъда кори комилан пӯшидаи қубур мебошад, ки коркарди пас аз ПТР-ро талаб намекунад ва аз камбудиҳои зиёд дар амалиёти анъанавии ПТР канорагирӣ мекунад.Дар таҷриба одатан циклери гармии PCR ABI7100 истифода мешавад, ки аз ҷониби ширкати PE таҳия шудааст.
Асбоб дорои хусусиятҳои зерин аст: ① Истифодаи васеъ: Он метавонад барои муайян кардани миқдори маҳсулоти ДНК ва РНК ПТР, таҳқиқоти экспрессияи генҳо, ошкор кардани патогенҳо ва оптимизатсияи шароити ПТР истифода шавад.② Принсипи беназири миқдорӣ: Бо истифода аз зондҳои флюоресцентӣ, миқдори флуоресцентсия бо давраи PCR пас аз барангезиши лазер ҷамъ мешавад, то ба ҳадафи миқдорӣ ноил шавад.③ Самаранокии баланди корӣ: Сикли гармидиҳии 9600 PCR дарунсохташуда, компютер аз 1 то 2 соат идора карда мешавад, то тақвият ва миқдори 96 намунаро ба таври худкор ва синхронӣ анҷом диҳад.④ Барои электрофорези гел лозим нест: Намунаро ҳал кардан ва электрофорез кардан лозим нест, танҳо барои муайян кардани бевосита дар найчаи реаксия аз зондҳои махсус истифода баред.⑤Дар қубур ифлосшавӣ вуҷуд надорад: найчаи беҳамтои реаксияи пурра пӯшида ва системаи интиқоли фотоэлектрикӣ қабул карда шудааст, бинобар ин дар бораи ифлосшавӣ хавотир шудан лозим нест.⑥Натиҷаҳо такроршавандаанд: диапазони динамикии миқдорӣ то панҷ дараҷаи бузургӣ аст.Аз ин рӯ, азбаски ин технология бомуваффақият таҳия карда шуд, он аз ҷониби бисёре аз муҳаққиқони илмӣ қадр карда шуд ва дар бисёр соҳаҳо татбиқ карда шуд.
2 Принсипҳо ва усулҳо
Принсипи кори FQ-PCR аз истифодаи фаъолияти 5′→3′ экзонуклеазаи ферменти Taq барои илова кардани зонд бо флюоресцентӣ ба системаи реаксияи PCR иборат аст.Зонд метавонад махсусан бо қолаби ДНК, ки дар пайдарпаии праймер мавҷуд аст, гибридизатсия карда шавад.5'-нӯги зонд бо гени эмиссияи флуоресценти FAM (6-карбоксифлуоресцеин, қуллаи партоби флуоресцент дар 518 нм) ва 3'-нӯги бо гурӯҳи хомӯшкунандаи флуоресценти TAMRA (6-карбокситетраметилродамин, протсессори флуоресценти 28 нм) нишон дода шудааст. фосфоризатсия карда мешавад, то ки зонд ҳангоми тақвияти ПЗР дароз карда нашавад.Вақте ки зонд бетағйир мемонад, гурӯҳи хомӯшкунанда партови флуорессенси гурӯҳи эминкуниро қатъ мекунад.Пас аз он ки гурӯҳи эмитент аз гурӯҳи хомӯшкунанда ҷудо мешавад, монеъшавӣ бардошта мешавад ва зичии оптикӣ дар 518 нм зиёд мешавад ва тавассути системаи муайянкунии флуоресцентҳо муайян карда мешавад. Дар марҳилаи ренатуратсия зонд бо ДНК-и қолаби гибридизатсия мешавад ва ферменти Taq дар марҳилаи васеъшавӣ дар баробари template аз ДНК ҳаракат мекунад.Вақте ки зонд бурида мешавад, эффекти хомӯшкунӣ бароварда мешавад ва сигнали флуоресцентӣ бароварда мешавад.Ҳар дафъае, ки қолаб нусхабардорӣ мешавад, зонд бо пахши сигнали флуоресцентӣ бурида мешавад.Азбаски байни шумораи флюорофорҳои баровардашуда ва шумораи маҳсулоти PCR робитаи як ба як вуҷуд дорад, ин усулро барои дақиқ муайян кардани қолаб истифода бурдан мумкин аст.Асбоби таҷрибавӣ одатан циклери гармии ABI7100 PCR-ро истифода мебарад, ки аз ҷониби ширкати PE таҳия шудааст ва дигар сиклҳои гармидиҳӣ низ метавонанд истифода шаванд.Агар барои таҷриба системаи реаксияи навъи ABI7700 истифода шавад, пас аз анҷоми реаксия, натиҷаҳои миқдорӣ метавонанд мустақиман тавассути таҳлили компютерӣ дода шаванд.Агар шумо дигар давраҳои гармиро истифода баред, ба шумо лозим аст, ки детектори флуоресцентиро барои чен кардани сигнали флуоресцент дар найчаи реаксия ҳамзамон барои ҳисоб кардани RQ+, RQ-, △RQ истифода баред.RQ+ таносуби шиддатнокии люминесцентии гурӯҳи партовҳои флуоресцентии найчаи намунаро ба шиддатнокии люминессенси гурӯҳи хомӯшкунанда нишон медиҳад, RQ- таносуби ду дар найчаи холиро ифода мекунад, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) миқдори флюоресцентро дар ҷараёни коркарди маълумот ба даст оварда метавонад.Ба туфайли чорй намудани зондхои флуоресцентй хусусияти тачриба хеле бехтар мегардад.Тарҳрезии зонд дар маҷмӯъ бояд ба шартҳои зерин ҷавобгӯ бошад: ①Дарозии зонд бояд тақрибан 20-40 поя бошад, то хусусияти пайвастшавиро таъмин намояд.②Мазмуни асосҳои GC аз 40% то 60% аст, то такроршавии пайдарпайии як нуклеотид пешгирӣ карда шавад.③ Аз гибридизатсия худдорӣ кунед ё бо праймерҳо такрор кунед.④ Устувории пайвастшавӣ байни зонд ва қолаб аз устувории пайвастшавӣ байни праймер ва қолаб бузургтар аст, бинобар ин арзиши Tm-и зонд бояд на камтар аз 5°C аз арзиши Tm-и праймер баландтар бошад.Илова бар ин, консентратсияи зонд, гомологияи байни зонд ва пайдарпаии шаблон ва масофаи байни зонд ва праймер ҳама ба натиҷаҳои таҷриба таъсир мерасонанд.
Маҳсулоти марбут:
Чин Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Истеҳсолкунанда ва Таъминкунанда |Foregene (foreivd.com)
Вақти фиристодан: октябр-15-2021
