Дар таҷрибаҳои qPCR, тарҳи ибтидоӣ низ як пайванди хеле муҳим аст.Новобаста аз он ки праймерҳо мувофиқанд ё не, ба он вобаста аст, ки оё самаранокии тақвият ба стандарт мерасад, оё маҳсулоти пурқувватшуда мушаххас аст ва оё натиҷаҳои таҷрибавӣ дастрасанд.
Пас, чӣ гуна бояд хусусияти ибтидоии qPCR беҳтар шавад?Самаранокии баланди тақвият?
Имрӯз, мо шуморо ба тарҳрезии праймерҳои qPCR якҷоя мебарем ва бигзоред, ки тарроҳии праймери qPCR дар таҷрибаҳо як маҳорати муассири дониш гардад.
Ҳангоми тарҳрезии праймерҳои qPCR, одатан ба нуктаҳои зерин диққат диҳед: праймерҳо бояд то ҳадди имкон дар саросари интронҳо тарҳрезӣ шаванд, дарозии маҳсулот бояд 100-300 bp бошад, арзиши Tm бояд то ҳадди имкон ба 60 ° C наздик бошад ва праймерҳои болоӣ ва поёнӣ бояд ба қадри имкон наздик бошанд ва охири праймер бояд G ё C интизор шавад.
1. Тарҳрезии праймерҳо, ки интронҳоро фаро мегиранд
Ҳангоми тарҳрезии праймерҳои qPCR, интихоби праймерҳое, ки дар байни интронҳо тарҳрезӣ шудаанд, метавонад аз пурқувват шудани қолаби gDNA пешгирӣ кунад ва маҳсулот ҳама аз амплификацияи cDNA гирифта шуда, ба ин васила таъсири ифлосшавии gDNA-ро аз байн мебаранд.
2. Дарозии ибтидоӣ
Дарозии ибтидоӣ одатан байни 18-30 нт аст ва дарозии маҳсулоти пурқувват бояд то ҳадди имкон дар байни 100-300 bp назорат карда шавад.
Агар праймер хеле кӯтоҳ бошад, он ба амплификацияи ғайримуқаррарӣ оварда мерасонад ва агар он хеле дароз бошад, он ба осонӣ сохтори дуюмдараҷаро ташкил медиҳад (масалан, сохтори мӯй).Агар маҳсулоти амплификация хеле дароз бошад, он барои реаксияи полимераз мувофиқ нест, ки ба самаранокии пурқувваткунии PCR таъсир мерасонад.
3. Мазмуни GC ва арзиши Tm
Мазмуни GC-и праймерҳо бояд аз 40% то 60% назорат карда шавад.Агар он хеле баланд ё хеле паст бошад, он барои оғози реаксия мусоидат намекунад.Мазмуни GC-и праймерҳои пеш ва баръакс бояд ба якхела наздик бошад, то арзиши якхелаи Tm ва ҳарорати гармкунӣ ба даст оварда шавад.
Қимати Tm бояд то ҳадди имкон дар байни 55-65°С, умуман тақрибан 60°С бошад ва арзиши Tm дар болооб ва поёноб бояд ба қадри имкон наздик бошад, беҳтараш на бештар аз 4°С.
4. Аз интихоби A дар 3′ охири праймер худдорӣ кунед
Вақте ки охири 3'-и праймер номувофиқ аст, дар самаранокии синтези асосҳои гуногун фарқиятҳои калон мавҷуданд.Вақте ки пойгоҳи охирин А аст, он инчунин метавонад синтези занҷирро ҳатто дар ҳолати номувофиқӣ оғоз кунад ва вақте ки пойгоҳи охирин T бошад, самаранокии индуксияи номувофиқӣ хеле кам мешавад.Аз ин рӯ, кӯшиш кунед, ки аз интихоби A дар охири 3′ ибтидоӣ канорагирӣ кунед ва беҳтараш Т-ро интихоб кунед.
Агар он праймери зонд бошад, охири 5'-и зонд наметавонад G бошад, зеро ҳатто вақте ки як пойгоҳи ягонаи G ба гурӯҳи гузоришгари флуоресцентии FAM пайваст аст, G инчунин метавонад сигнали флуоресцентии аз ҷониби гурӯҳи FAM баровардашударо хомӯш кунад, ки дар натиҷа натиҷаҳои манфии бардурӯғ ба вуҷуд меоянд.Пайдо шудан.
5. Тақсимоти базавӣ
Тақсимоти чаҳор асос дар праймер беҳтараш тасодуфӣ буда, аз 3 пай дар пайи G ё C дар охири 3′ ва зиёда аз 3 пайдарпай канорагирӣ мекунад.G ё C тавлид кардани ҷуфтшавӣ дар минтақаи пайдарпаии аз GC бой осон аст.
6. Минтақаи тарҳрезии ибтидоӣ бояд аз сохторҳои мураккаби дуввум канорагирӣ кунад.
Сохтори дуюмдараҷае, ки аз риштаи ягонаи маҳсули амплификация ташкил шудааст, ба пешрафти ҳамвори ПЗР таъсир мерасонад.Бо пешгӯии мавҷудияти сохтори дуюмдараҷа дар пайдарпаии мақсаднок пешакӣ кӯшиш кунед, ки дар тарҳрезии праймерҳо аз ин минтақа канорагирӣ кунед.
7. Худи праймерҳо ва байни праймерҳо бояд кӯшиш кунанд, ки аз пойгоҳҳои пайдарпайи иловагӣ канорагирӣ кунанд.
Байни худи праймер ва праймер ягон иловагии пайдарпайи 4 асос вуҷуд дошта наметавонад.Худи праймер набояд пайдарпайии иловагиро дошта бошад, вагарна он худро печонида, сохтори мӯи сарро ташкил медиҳад, ки ба омезиши гармкунии праймер ва қолаб таъсир мерасонад.
Пайдарпайвандҳои иловагӣ наметавонанд байни праймерҳои боло ва поён вуҷуд дошта бошанд.Мукаммалии байни праймерҳо димерҳои ибтидоиро ба вуҷуд меорад, ки самаранокии PCR-ро коҳиш медиҳад ва ҳатто ба дақиқии миқдорӣ таъсир мерасонад.Агар сохторҳои праймер-димер ва мӯй ногузир бошанд, арзиши △G набояд аз ҳад зиёд баланд бошад (бояд аз 4,5 ккал/мол камтар бошад).
8. Примерҳо маҳсулоти мушаххаси мақсаднокро тақвият медиҳанд.
Ҳадафи ниҳоии муайянкунии qPCR ин фаҳмидани фаровонии гени мақсаднок аст.Агар амплификацияи ғайримуқаррарӣ рух диҳад, миқдор нодуруст хоҳад буд.Аз ин рӯ, пас аз тарҳрезии праймерҳо, онҳо бояд аз ҷониби BLAST санҷида шаванд ва хусусияти маҳсулот дар пойгоҳи додаҳои пайдарпай муқоиса карда мешавад.
Баъдан, мо гени GAS6 (Growth arrest specific 6)-и инсонро ҳамчун намуна барои тарҳрезии праймерҳои qPCR мегирем.
01 гени дархост
Homo GAS6тавассути NCBI.Дар ин ҷо, мо бояд ба муқоисаи номи ген ва намудҳо диққат диҳем, то мувофиқат кунанд.
02 Пайдо кардани пайдарпайии ген
(1) Агар пайдарпаии ҳадаф ДНК-и геномӣ бошад, аввалинашро интихоб кунед, ки он пайдарпаии ДНК-и геномии ген аст.
(2) Агар пайдарпаии ҳадаф mRNA бошад, дуюмашро интихоб кунед.Пас аз ворид шудан, дар ҷадвали зер "CDS" -ро клик кунед.пайдарпаии замина қаҳваранг пайдарпаии рамзгузории ген аст.
03 Примерҳои тарроҳӣ
Интерфейси Primer-BLAST-ро ворид кунед
Рақами пайдарпайии ген ё пайдарпаиро дар формати Fasta дар тарафи чапи боло ворид кунед ва параметрҳои дахлдорро пур кунед.

"Get primers" -ро клик кунед ва NCBI пайдо мешавад, то ба шумо бигӯяд, ки чунин интихоби параметр ба дигар вариантҳои пайвасткунӣ тақвият дода мешавад.Мо метавонем вариантҳои гуногуни пайвасткуниро тафтиш кунем ва онҳоро барои гирифтани ҷуфти мувофиқ пешниҳод кунем (тавре ки дар расми зер нишон дода шудааст).Ин раванд метавонад даҳҳо сонияро дар бар гирад.
Ҳарорати тозакунии ин ҷуфтҳои ибтидоӣ тақрибан 60 ° C аст.Мувофики максади тачриба примерхоро бо дарозии муътадил, хусусияти хуб ва камху-нии худ пурра кардани праймерхо барои тачриба интихоб кунед ва дарачаи муваффакиятнок хеле баланд аст!
04 Санҷиши мушаххасоти ибтидоӣ
Дар асл, ба ғайр аз тарроҳии праймерҳо, Primer-Blast инчунин метавонад праймерҳоеро, ки мо худамон тарроҳӣ кардаем, арзёбӣ кунад.Ба саҳифаи тарроҳии ибтидоӣ баргардед, праймерҳои боло ва поёнобиро, ки мо тарҳрезӣ кардаем, ворид кунед ва дигар параметрҳо танзим карда намешаванд.Пас аз пешниҳод, шумо метавонед бубинед, ки оё ҷуфти праймерҳо дар генҳои дигар низ вуҷуд доранд.Агар ҳамаи онҳо дар ген нишон дода шаванд, мо мехоҳем тақвият диҳем, ин нишон медиҳад, ки хусусияти ин ҷуфти праймерҳо бузург аст!(Масалан, ин ягона натиҷаи дархости ибтидоӣ аст!)

05 Арзёбии сифати ибтидоӣ
Примери "комил", ки "самаранокии пурзӯркуниро то стандарт", "хусусиятҳои пурқувватшудаи маҳсулот" ва "натиҷаҳои боэътимоди таҷрибавӣ" -ро муттаҳид мекунад, чӣ гуна праймер аст?
Самаранокии тақвият

каҷи обшавии
Самаранокии пурқувваткунии праймерҳо ба 90%-110% мерасад, ки ин маънои онро дорад, ки самаранокии пурқувваткунӣ хуб аст ва каҷи обшавӣ як қуллаи ягона дорад ва одатан Tm>80°C, яъне хусусияти пурқувваткунӣ хуб аст.
 
Маҳсулоти марбут:
Дар вақти воқеӣ PCR Easy – SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman