PCR дар вақти воқеӣ, ки бо номи PCR-и миқдорӣ ё qPCR низ маълум аст, як усули мониторинг ва таҳлили маҳсулоти пурқувваткунандаи PCR дар вақти воқеӣ мебошад.
Азбаски ПЗР-и миқдорӣ дорои бартариҳои амалиёти оддӣ, зуд ва қулай, ҳассосияти баланд, такроршавандагии хуб ва сатҳи пасти ифлосшавӣ мебошад, он дар санҷиши тиббӣ, арзёбии самаранокии маводи мухаддир, таҳқиқоти экспрессияи генҳо, тадқиқоти трансгенӣ, ошкор кардани генҳо, ошкор кардани патогенҳо, ҳайвонот ва растаниҳо васеъ истифода мешавад., озмоиши озукаворй ва дигар сохахо.
Аз ин рӯ, хоҳ шумо бо тадқиқоти бунёдӣ дар соҳаи илмҳои ҳаёт машғул бошед, хоҳ кормандони ширкатҳои фармасевтӣ, ширкатҳои чорводорӣ, ширкатҳои хӯрокворӣ, ё ҳатто кормандони бюроҳои воридотӣ ва карантинӣ, шӯъбаҳои мониторинги муҳити зист, беморхонаҳо ва дигар бахшҳо, шумо камтар ё камтар дучор мешавед ё ба шумо лозим аст, ки дониши азхудкунии миқдории PCR-ро бидонед.

Принсипи PCR дар вақти воқеӣ

ПТР дар вақти воқеӣ усулест, ки дар он ба системаи реаксияи ПТР моддаҳои флуоресцентӣ илова карда мешаванд ва шиддатнокии сигнали флуоресцентӣ дар раванди реаксияи ПТР дар вақти воқеӣ тавассути асбоби миқдорӣ ПЗР назорат карда мешавад ва дар ниҳоят маълумоти таҷрибавӣ таҳлил ва коркард карда мешавад.

【Хатти амплификация】каҷест, ки раванди динамикии PCR-ро тавсиф мекунад.Каҷи пурқувваткунии PCR аслан каҷи стандартии экспоненсиалӣ нест, балки каҷи сигмоид аст.

[Марҳилаи платформаи каҷи тақвият]Бо зиёд шудани шумораи давраҳои ПТР, ғайрифаъолшавии полимерази ДНК, кам шудани dNTPs ва праймерҳо ва ҷилавгирӣ аз реаксияи синтез тавассути реаксияи пирофосфати иловаги ва ғайра, ПТР на ҳамеша ба таври экспоненсиалӣ васеъ мешавад., ва окибат ба плато дохил мешавад.

[Минтақаи афзоиши экспоненсиалии каҷи амплификация]Гарчанде ки марҳилаи плато хеле фарқ мекунад, дар як минтақаи муайяни минтақаи афзоиши экспоненсиалии хатти амплификация, такрорпазирӣ хеле хуб аст, ки барои таҳлили миқдории ПЗР хеле муҳим аст.

[Арзиши ҳадди аксар ва арзиши Ct]Мо арзиши лимити кашфи флуоресцентро дар мавқеъи мувофиқ дар майдони афзоиши экспоненсиалии хатти пурқувват, яъне арзиши ҳадди (ҳадди) муқаррар кардем.Нуқтаи буриши арзиши ҳадди ниҳоӣ ва каҷи пурқувваткунӣ арзиши Ct мебошад, яъне арзиши Ct ба шумораи давраҳо (Сикли остона) ҳангоми расидан ба арзиши ҳадди ниҳоӣ ишора мекунад.

Графикаи зер робитаи байни хати остона ва каҷи пурқувват, ҳадди ва арзиши Ct-ро равшан нишон медиҳад.

【Чӣ тавр ҳисоб кардан мумкин аст?】

Бо назарияи математикӣ исбот шудааст, ки арзиши Ct бо логарифми шумораи қолибҳои ибтидоӣ робитаи хаттии баръакс дорад.PCR дар вақти воқеӣ маҳсулоти пурқувваткунии PCR-ро дар вақти воқеӣ назорат мекунад ва миқдори онҳоро дар марҳилаи тақвияти экспоненсиалӣ муайян мекунад.

Барои ҳар як давраи PCR, ДНК ба таври экспоненсиалӣ 2 маротиба зиёд шуд ва ба зудӣ ба плато расид.

Фарз мекунем, ки миқдори ДНК-и ибтидоӣ А₀ , пас аз n давра, миқдори назариявии маҳсулоти ДНК метавонад чунин ифода карда шавад:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Пас, ҳар қадар миқдори ибтидоии ДНК A 0 зиёд бошад, ҳамон қадар зудтар миқдори маҳсулоти пурқувватшуда ба арзиши муайянкунии An мерасад ва шумораи давраҳо ҳангоми расидан ба An арзиши Ct мебошад.Яъне, ҳар қадар миқдори ибтидоии ДНК A 0 зиёд бошад, ҳамон қадар хати каҷи амплификация ба авҷи аъло мерасад ва мутаносибан шумораи зарурии давраҳои n камтар мешавад.

Мо градиентии стандарти консентратсияи маълумро иҷро мекунем ва онро ҳамчун қолаби PCR дар вақти воқеӣ истифода мебарем ва як қатор каҷҳои амплификация бо фосилаҳои баробар бо тартиби саршавии миқдори ДНК аз зиёд то камтар ба даст оварда мешаванд.Мувофиқи муносибати хаттии байни арзиши Ct ва логарифми шумораи қолабҳои ибтидоӣ,[каҷи стандартӣ] эҷод кардан мумкин аст.

Бо иваз кардани арзиши Ct-и намуна бо консентратсияи номаълум ба каҷи стандартӣ, миқдори ибтидоии қолаби намунаи консентратсияи номаълумро ба даст овардан мумкин аст, ки ин принсипи миқдории PCR дар вақти воқеӣ мебошад.

Усули муайянкунии PCR дар вақти воқеӣ

PCR дар вақти воқеӣ маҳсулоти пурқувваткунандаи PCR-ро тавассути муайян кардани шиддатнокии флуоресцент дар системаи реаксия муайян мекунад.

Принсипи усули ҷобаҷогузории рангҳои флуоресцентӣ】

Рангҳои флуоресцентӣ, ба монанди TB Green ®, метавонад ба таври ғайримуқаррарӣ ба ДНК-и дуқатор дар системаҳои PCR пайваст шавад ва ҳангоми пайвастшавӣ флуорессия кунад.

Шиддати флуоресцентсия дар системаи реаксия бо афзоиши давраҳои PCR ба таври экспоненсиалӣ зиёд шуд.Бо муайян кардани шиддатнокии флуоресцент, миқдори амплификацияи ДНК дар системаи реаксия метавонад дар вақти воқеӣ назорат карда шавад ва сипас миқдори қолаби ибтидоӣ дар намуна метавонад баръакс ҳисоб карда шавад.

【Принсипи усули зондҳои флуоресцентӣ】

зонди флуоресцентӣпайдарпаии кислотаи нуклеинӣ бо гурӯҳи флуоресцентӣ дар охири 5′ ва гурӯҳи хомӯшкунанда дар охири 3′ мебошад, ки метавонад ба таври махсус ба қолаб пайваст шавад.Вақте ки зонд солим аст, флуорессенсияе, ки флюорофор мебарорад, аз ҷониби гурӯҳи хомӯшкунанда хомӯш карда мешавад ва флуорессия наметавонад.Вақте ки зонд таҷзия мешавад, моддаи флуоресцентӣ пароканда мешавад ва флуорессент мебарорад.

Ба маҳлули реаксияи PCR зондҳои флуоресцентӣ илова карда мешаванд.Ҳангоми коркард, зондҳои флуоресцентӣ ба мавқеи мушаххаси қолаб пайваст мешаванд.Дар ҷараёни васеъшавӣ, фаъолияти 5'→3' экзонуклеазаи ферменти ПТР метавонад зондҳои флуоресцентиро, ки бо қолаб гибрид карда шудаанд, таҷзия кунад ва моддаи флуоресцентӣ барои паҳн кардани флуоресцент ҷудо карда мешавад.Бо муайян кардани шиддатнокии флуорессенсияи зонд дар системаи реаксия, ба ҳадафи мониторинги миқдори пурқувваткунии маҳсулоти PCR ноил шудан мумкин аст.

【Интихоби усули муайянкунии флуоресцент】

Агар он барои фарқ кардани пайдарпаии дорои гомологияи баланд ва иҷрои мултиплексии муайянкунии PCR ба монанди таҳлили чопкунии SNP истифода шавад, усули зондҳои флуоресцентӣ ивазнашаванда аст.
Барои дигар таҷрибаҳои PCR дар вақти воқеӣ метавон усули одди, осон ва арзони химераи флуоресцентиро истифода бурд.

probes Хусусияти қавӣ, қодир ба мултиплекс PCR

Камбудӣ

Талаботи баланди хосият барои тақвият;

мултиплекси ПТР иҷро карда намешавад.Таҳияи зондҳои мушаххас, арзиши баланд;

баъзан тарҳрезии зонд душвор аст

Маҳсулоти марбут: