PCR, сершумор PCR, Дар ҷои PCR, PCR баръакс, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Мо консепсияҳо, қадамҳо ва тафсилоти гуногуни PCR-ро ҷудо мекунем

Ⅰ. PCR

Реаксияи занҷири полимераз, ки ҳамчун PCR номида мешавад, як технологияи биологии молекулавӣ мебошад, ки барои васеъ кардани пораҳои мушаххаси ДНК истифода мешавад.Онро метавон ҳамчун репликатсияи махсуси ДНК дар vitro баррасӣ кард.Полимеразаи ДНК (ДНК Полимераза I) ҳанӯз дар соли 1955 кашф шуда буд ва Фрагменти Кленови E. Coli, ки арзиши таҷрибавӣ ва амалӣ дорад, аз ҷониби доктор Ҳ.Кленоу дар аввали солҳои 1970 кашф карда шуд, аммо азбаски ин фермент ҳароратро таҳаммул намекунад, ҳарорати баланд метавонад онро таназзул кунад, бинобар ин ба реаксияи дегенеразаи баланди полимераза мувофиқат намекунад.Ферментҳое, ки имрӯз истифода мешаванд (бо номи Taq polymerase) аз Thermus aquaticus, як бактерияи чашмаи гарм дар соли 1976 ҷудо карда шудаанд. Хусусияти он дар он аст, ки он ба ҳарорати баланд тоб оварда метавонад ва як ферменти идеалист, аммо пас аз солҳои 1980 васеъ истифода мешавад.Консепсияи аслии прототипи ибтидоии ПЗР ба таъмири генҳо ва нусхабардорӣ шабоҳат дорад, ки онро доктор КҶелл Клеппе дар соли 1971 пешниҳод карда буд. Вай аввалин нусхаи содда ва кӯтоҳмуддати генро нашр кард (монанди ду реаксияи даври аввали ПЗР).ПТР-ро, ки имрӯз таҳия шудааст, дар соли 1983 доктор Кари Б. Муллис таҳия кардааст. Доктор Муллис он сол ба ширкатҳои PE хидмат мекард, аз ин рӯ, PE дар саноати PCR мақоми махсус дорад.Доктор Муллис соли 1985 аввалин мақолаи марбут ба Сайки ва дигаронро расман нашр кард. Аз он вақт инҷониб, истифодаи PCR дар як рӯз ҳазорҳо милро ташкил медиҳад ва метавон гуфт, ки сифати ҳуҷҷатҳои марбута бисёр усулҳои дигари тадқиқотро нописанд мекунад.Минбаъд, технологияи PCR дар тадқиқоти илмии биологӣ ва татбиқи клиникӣ васеъ истифода мешавад ва ба технологияи муҳимтарини тадқиқоти биологияи молекулавӣ табдил меёбад.Муллис соли 1993 низ барандаи ҷоизаи Нобел дар бахши кимиё шуд.

PCRПринсип

Принсипи асосии технологияи ПТР ба раванди репликатсияи табиии ДНК шабоҳат дорад ва хосияти он аз праймери олигонуклеотид вобаста аст, ки ба ҳарду ақсои пайдарпайи ҳадаф пурракунанда аст.ПТР аз се марҳилаи реаксияҳои асосии дегенератсия-тавҳшави-васеъкунанда иборат аст: ①Денгенератсияи ДНК-и қолабӣ: Пас аз он ки ДНК-и қолабӣ барои муддати муайян тақрибан то 93°C гарм карда мешавад, маҳлули дугонаи ДНК барои ДНК-и дузанҷир, ки дар натиҷаи амплификацияи ПТР-и қолаб ба вуҷуд омадааст, метавонад ДНК-и ягонаро барои омехта омода созад. реаксияи даврӣ.②Тағйирёбии (пайванди) ДНК-и қолаб ва праймер: Пас аз гарм кардани ДНК-и қолабӣ ба занҷири ягона, ҳарорат тақрибан то 55°C паст мешавад.пайдарпайии пурраи праймер ва Шаблон ДНК як-занҷири.③Дастшавии праймер: Шаблони ДНК-пайвасткунии праймер ба амали полимеразаи TaqDNA бо dNTP ҳамчун ашёи хоми реаксия асос ёфтааст.Принсипи репликатсияро риоя кунед, занҷири нави нусхабардории нимҳифзшударо, ки занҷири ДНК-и қолабиро мукаммал созад, синтез кунед ва се равандро такрор кунед, дегенератсия-тавсф кардан-тавассути се раванд метавонад бештар “занҷири нусхаи нимҳифзшуда” ба даст орад ва ин занҷири нав боз дастрас аст Шаблон барои давраи оянда шавед.Барои анҷом додани ҳалқа 2-4 дақиқа вақт лозим аст, гени мақсаднокро дар 2-3 соат якчанд миллион маротиба афзоиш додан мумкин аст.

СтандартPCRСистемаи реаксия

Панҷ унсури реаксияи PCR

Дар реаксияи ПТР асосан панҷ намуди моддаҳо иштирок мекунанд, яъне праймер, фермент, dNTP, шаблон ва буфер (Mg2+ лозим аст).[Расидани PCR]

Раванди стандартии PCR ба се марҳила тақсим мешавад

1. Дегенератсияи ДНК (90°C-96°C): Шаблонҳои дузанҷираи ДНК дар зери таъсири гармӣ, пайвандҳои гидрогенӣ шикаста, як ДНК-и занҷирро ташкил медиҳанд.

2. Табобат (25℃ -65℃): Ҳарорати система паст мешавад, праймер бо қолаби ДНК якҷоя карда мешавад, то як занҷири дугонаи маҳаллӣ ташкил кунад.

3. Васеъ (70 ℃ -75 ℃): Дар зери амали enzyme Taq (тақрибан 72 ° C, беҳтарин фаъолият), dNTP ҳамчун ашёи хом истифода мешавад, аз 5 ′ охири праймер → 3′ охири, синтез ва қолаби дигар занҷири ДНК-ро пурра мекунанд.

Ҳар як давра денатурат карда, таҳшин ва дароз карда мешавад, ки мундариҷаи ДНК-ро дучанд мекунад.Дар айни замон, аз сабаби кӯтоҳ будани майдони амплификация, баъзе PCR-ро дар муддати хеле кӯтоҳ метавон такрор кард, ҳатто агар фаъолияти ферментҳои Taq оптималӣ набошад, аз ин рӯ онро ба ду марҳила иваз кардан мумкин аст, яъне гармкунӣ ва васеъкуниро дар як вақт дар 60 ° C-65 ° C иҷро кардан мумкин аст.Бо мақсади кам кардани раванди бардоштан ва хунуккунӣ ва беҳтар кардани суръати ҷавоб.

Хусусиятҳои реаксияи PCR

● Мушаххасоти баланд

Омилҳои мушаххаси ҳалкунандаи посухи ПТР инҳоянд: ①Маҷмӯи мушаххаси праймер ва ДНК-и қолабӣ.②Принсипи ҷуфткунии асосҳо.③Садоқати реаксияи синтези полимеразаи TaqDNA.④Хусусият ва консервативии гени мақсаднок.

Омезиши дурусти праймерҳо ва қолибҳо калид аст.Пайвасткунии праймер ва қолаб ва дароз кардани занҷири ибтидоӣ ба принсипи мувофиқати асоси сілтӣ асос ёфтааст.Вафодории реаксияҳои синтези полимераз ва муқовимати баланди ҳарорати полимеразаи Так ДНК барои пайвастани (пайванди) қолаб ва праймер дар реаксия метавонад дар ҳарорати баландтар иҷро карда шавад.Хусусияти комбинат хеле зиёд мешавад.Клип метавонад дараҷаи баланди дурустиро нигоҳ дорад.Бо интихоби минтақаи генетикии мақсаднок бо консервативии баланд ва консервативии баланд, хосияти он баландтар аст.

● Ҳассосияти баланд

Ҳаҷми истеҳсоли маҳсулоти ПТР аз рӯи индекс зиёд карда мешавад, ки он метавонад қолаби ибтидоии Picker (PG=10-12) васеъ карда, сатҳи микроконтроллерро ба сатҳи микрограммҳо (μg= -6) афзоиш диҳад.Ҳуҷайраҳои мақсаднокро аз 1 миллион ҳуҷайра муайян кардан мумкин аст;ҳангоми ошкор кардани вирусҳо, ҳассосияти ПЗР метавонад ба 3 РФ (доғҳои холӣ ташкил карда мешаванд) мерасад;сатҳи ҳадди ақали ошкор дар илми бактерия 3 бактерия аст.

● Содда ва зуд

Дар инъикоси PCR полимеразаи Taq DNA-и ҳарорати баландро истифода мебарад, ки маҳлули реаксияро дар як вақт илова мекунад, яъне реаксияи дегенератсия-тавассути васеъшавӣ дар маҳлули амплификацияи ДНК ва деги ванна об.Умуман, реаксияи амплификация дар давоми 2 то 4 соат анҷом меёбад.Маҳсулоти афзоишёфта одатан бо шамшери барқӣ таҳлил карда мешаванд ва набояд изотопҳо, ифлосшавии радиоактивӣ ва таблиғи осонро истифода баранд.

● Тозагии намуна паст аст

Зарурати ҷудо кардани вирусҳо ё бактерияҳо ва ҳуҷайраҳои фарҳангӣ нест.Маҳсулоти хоми ДНК ва РНК метавонанд ҳамчун пурқувваткунанда истифода шаванд.Муайян кардани амплификацияи ДНК метавонад мустақиман бо истифода аз намунаҳои клиникӣ ба монанди хун, моеъи бадан, моеъи шустани сулфа, мӯй, ҳуҷайраҳо ва бофтаи зинда истифода шавад.

PCRмушкилоти умумӣ

● Манфии бардурӯғ, бандҳои пурқувват нест

Марҳилаҳои асосии реаксияи ПТР иборатанд аз: ① тайёр кардани кислотаҳои нуклеинҳои шаблон, ② сифат ва хосияти праймерҳо, ③ сифати ферментҳо ④ шароити давраи ПТР.Ҷустуҷӯи сабабро низ бояд барои истинодҳои боло таҳлил ва омӯхта шавад.

Шаблонҳо: ① Шаблон дорои сафедаҳои гуногун аст, ② Шаблон дорои ингибитори ферментҳои Taq мебошад, ③ Протеин дар қолаб нест карда намешавад, махсусан сафедаи гурӯҳӣ дар хромосома.⑤ Дегенератсияи кислотаи нуклеинҳои деминерӣ пурра нест.Вақте ки сифати ферментҳо ва праймерҳо хуб аст, банди амплификация вуҷуд надорад, ки эҳтимолан табобати ҳозимаи намунаҳост.Дар раванди истихроҷи кислотаи нуклеинӣ дар шаблон чизе нодуруст аст, аз ин рӯ барои омода кардани маҳлули муассир ва устувори ҳозима, тартиби он бояд ислоҳ карда шавад ва худсарона тағир дода нашавад.

Бефаъолшавии фермент: ферментҳои нав ё ҳам ферментҳои кӯҳна ва ҳам нав бояд якҷоя истифода шаванд, ки оё фаъолияти фермент гум шудааст ё нокифоя аст, ки боиси манфиҳои бардурӯғ мегардад.Бояд гуфт, ки ферменти Так ё бромиди этидиум баъзан фаромуш мешавад.

Пример: сифати праймер, консентратсияи праймер ва оё консентратсияи ду праймер симметрӣ аст.Ин як сабаби маъмулии нокомии PCR аст ё банди афзоянда идеалӣ нест ва ба паҳншавӣ майл дорад.Дар бобати сифати примерхои баъзе ракамхои партия проблемахо мавчуданд.Ду праймер консентратсияи баланд ва консентратсияи паст доранд, ки боиси амплификацияи асимметрии камсамар мешаванд.Чораҳои муқобил инҳоянд: ① Барои синтез кардани воҳидҳо праймери хуберо интихоб кунед.② Консентратсияи праймер на танҳо аз арзиши OD вобаста аст, балки инчунин ба моеъи аслии праймер диққат медиҳад, то электрофорези гели шакарро эҷод кунад.Бояд як минтақаи рахи праймер мавҷуд бошад ва равшании ду праймер бояд ба таври умум мувофиқ бошанд.Камар, PCR метавонад дар ин вақт ноком шавад ва он бояд бо воҳиди синтези праймер ҳал карда шавад.Агар праймер баланд бошад, равшанӣ паст аст ва консентратсияи он бояд ҳангоми ҳалшуда мутавозин бошад.③ Праймер бояд пардохта шавад ва дар консентратсияи баланд нигоҳ дошта шавад, то қисмҳои зиёди яхкунӣ ё яхдонҳои дарозмуддати яхдонро пешгирӣ кунад, ки ин боиси бад шудан ва таназзули праймер мегардад.④ Тарҳрезии праймер беасос аст, масалан, дарозии праймер нокифоя аст ва дар байни праймерҳо кластер ба вуҷуд омадааст.

Консентратсияи Mg2 + консентратсияи Mg2 + ион ба самаранокии пурқувваткунии PCR таъсири калон мерасонад.Консентратсияи аз ҳад зиёд метавонад ҷинси муқобили тақвияти PCR-ро коҳиш диҳад.Агар консентратсияи он хеле паст бошад, баромади пурзӯркунии PCR ҳатто бе банди васеъшавӣ нокомии пурқувваткунии PCR хоҳад кард.

Тағйир додани ҳаҷми реаксия: Ҳаҷме, ки дар пурзӯркунии ПЗР истифода мешавад, 20ul, 30ul ва 50ul ё 100uL мебошад, ҳаҷми зиёди дархост барои пурзӯркунии ПЗР мувофиқи мақсадҳои гуногуни тадқиқоти илмӣ ва санҷиши клиникӣ муқаррар карда мешавад.Пас аз сохтани ҳаҷми хурд, аз қабили 20ул, ҳангоми сохтани андоза шарти корд кардан лозим аст, вагарна он ноком мешавад.

Сабабҳои ҷисмонӣ: Трансформатсия барои тақвияти PCR хеле муҳим аст.Агар ҳарорати таназзул паст бошад, вақти таназзул кӯтоҳ аст, эҳтимоли он дар манфиҳои бардурӯғ рух медиҳад;ҳарорати аз ҳад пасти табобат метавонад тақвияти ғайримуқаррариро ба вуҷуд орад ва самаранокии мушаххасро коҳиш диҳад.Ба омезиши праймерҳо ва қолибҳо барои паст кардани самаранокии пурқувваткунии PCR ба таври назаррас таъсир мерасонад.Баъзан зарур аст, ки ҳароратсанҷҳои стандартиро барои муайян кардани тағирёбӣ, гармкунӣ ва ҳарорати дароз дар печи васеъ ё об ҳалшаванда истифода баред, ки яке аз сабабҳои нокомии PCR мебошад.

Вариантҳои пайдарпаии мақсаднок: Агар пайдарпаии ҳадаф рух диҳад, мутатсия ё несткунӣ, омезиши прототип ва қолаб якҷоя карда шавад ё аз сабаби набудани пайдарпайии ҳадаф, праймер ва қолаб пайдарпайии иловагиро аз даст медиҳанд ва тақвияти PCR он муваффақ нахоҳад шуд.

● мусбати бардурӯғ

Банди тақвияти PCR бо банди пайдарпайии ҳадаф мувофиқ ба назар мерасад ва баъзан банди он тозатар ва баландтар аст.

Тарҳрезии праймер мувофиқ нест: пайдарпаии амплификацияи интихобшуда ва пайдарпаии амплификацияи ғайримақсадӣ гомологӣ доранд, бинобар ин ҳангоми пурзӯркунии ПЗР, маҳсулоти пурқувватшудаи ПТР пайдарпайии ғайримақсаднок мебошанд.пайдарпайии ҳадаф хеле кӯтоҳ аст ё ибтидоӣ хеле кӯтоҳ аст, ва он моил ба мусбат бардурӯғ аст.Аз нав тарҳрезӣ кардан лозим аст.

Ифлосшавии байниҳамдигарии пайдарпаии мақсаднок ё маҳсулоти амплификация: Ду сабаб барои ин ифлосшавӣ вуҷуд дорад: Якум, ифлосшавии байниҳамдигарии тамоми геном ё сегментҳои калон, ки ба мусбатҳои бардурӯғ оварда мерасонад.Ин намуди мусбати бардурӯғро бо усулҳои зерин ҳал кардан мумкин аст: Ҳангоми кор эҳтиёт ва нарм бошед, то аз нафаскашии пайдарпаии ҳадаф ба таппончаи намунавӣ ё пошидан аз найчаи марказгурез пешгирӣ карда шавад.Ба гайр аз ферментхо ва моддахое, ки ба харорати баланд тоб оварда наметавонанд, хамаи реактивхо ва тачхизот бояд бо фишори баланд дезинфексия карда шаванд.Қубурҳои марказгурез ва намунаҳо бояд дар як вақт истифода шаванд.Ҳангоми зарурат, пеш аз илова кардани намунаҳо, найчаи реаксия ва реагент ба нурҳои ултрабунафш дучор мешаванд, то ки кислотаи мавҷудаи нуклеинро нест кунанд.Дуюм, пораҳои хурд дар ифлосшавии ҳаво.Ин порчаҳои хурд аз пайдарпаии мақсаднок кӯтоҳтаранд, аммо онҳо гомологияи муайян доранд.Онро метавон бо ҳам пайваст кард.Пас аз пурра кардани праймерҳо, маҳсулоти PCR метавонад васеъ карда шавад, ки боиси истеҳсоли мусбати бардурӯғ мегардад.Он метавонад барои кам ё аз байн бурдани усули PCR лона истифода шавад.

● Пайдо кардани бандҳои амплификацияи ғайримуқаррарӣ

Бастаҳое, ки пас аз пурзӯркунии ПЗР пайдо шудаанд, бо андозаи пешбинишуда, ё калон ё хурд, ё ҳамзамон, ё ҳамзамон, бандҳои мушаххаси амплификация ва бандҳои ғайримуқаррарӣ мувофиқат намекунанд.Пайдоиши бандҳои ғайримуқаррарӣ ин аст: Аввалан, праймерҳо ба пайдарпаии мақсаднок нопурра мебошанд ё полимеризатсияи праймер барои ташкили ди кластер.Дуюм ин аст, ки консентратсияи MG2 + ионҳо хеле баланд аст, ҳарорати табобат хеле паст аст ва шумораи давраҳои PCR алоқаманд аст.Дуюм, сифат ва миқдори ферментҳо.Аксар вақт, ферментҳои баъзе манбаъҳо ба бандҳои ғайримахсус майл доранд ва ферментҳои манбаи дигар ба вуҷуд намеоянд.Баъзан амплификацияи гайриспецификии ферментхо низ ба амал меояд.Чораҳои муқобил инҳоянд: дар ҳолати зарурӣ ҷаззобҳои аз нав тарҳрезишуда.Миқдори ферментро кам кунед ё ферменти манбаи дигарро иваз кунед.Миқдори ибтидоиро кам кунед, миқдори қолибҳоро ба таври мувофиқ зиёд кунед ва шумораи давраҳоро кам кунед.Ҳарорати гармкуниро дуруст баланд кунед ё усули ду нуқтаи ҳароратро истифода баред (дегенератсия 93 ° C, гармкунӣ ва дароз кардан дар тақрибан 65 ° C).

● Пӯшидани пора ё лентаи масҳ пайдо мешавад

Ба назар чунин мерасад, ки амплификацияи ПТР камарбанди истифодашуда ё пушонидашуда ё қолин монанд аст.Аз ин сабаб, аз хад зиёд будани ферментхо ё паст будани сифати фермент, консентратсияи dNTP хеле баланд, консентратсияи Mg2+ хеле баланд, ҳарорати гармкунӣ хеле паст ва шумораи давраҳо аз ҳад зиёд аст.Чораҳои муқобил инҳоянд: ①Коҳиш додани миқдори ферментҳо ё тағир додани ферментҳои манбаи дигар.②Коҳиши консентратсияи dNTP ③Консентратсияи Mg2+-ро дуруст кам кунед.④Миқдори қолабҳоро зиёд кунед ва шумораи давраҳоро кам кунед.

Маҳсулоти марбут

PCR Heroᵀᴹ (Бо ранг)

◮ Вафодории баланд: 6 маротиба аз ферментҳои оддии Taq;

◮ Суръати пурзӯртар

◮ Мутобиқсозии бештари шаблон

◮ Самаранокии баландтари тақвият

◮ Таҳаммулпазирии муҳити зист қавитар аст: дар давоми як ҳафта дар 37 ° C ҷойгир карда, беш аз 90% фаъолиятро нигоҳ медорад;

◮ Он дорои фаъолияти 5'→3' ДНК полимераза ва 5'→3' экзонуклеаза, бе фаъолияти экзонуклеаза 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (бо ранг)

Системаи беназири реаксия ва самаранокии баланди Taq DNA Polymerase реаксияи PCR-ро водор месозад, ки самаранокӣ, хосият ва ҳассосияти баландтар дошта бошад.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Як қадам)-SYBR Green I

◮ Маҷмӯаи якқадамӣ транскрипсияи баръакс ва qPCR ду реаксияро дар як найча месозад, танҳо лозим аст, ки шаблони РНК, праймерҳои мушаххаси PCR ва RNase-Free ddH илова кунед₂O.

◮ Маҷмӯа метавонад зуд ва самараноки миқдорӣ РНК-и вирусӣ ё пайгирии РНК-ро таҳлил кунад.

◮ Маҷмӯа реагенти беҳамтои транскрипсияи баръакси Foregene ва DNA Polymerase Foregene HotStar Taq-ро дар якҷоягӣ бо системаи беназири реаксия истифода мебарад, то самаранокии тақвият ва хосияти реаксияро самаранок беҳтар кунад.

◮ Системаи реаксияи оптимизатсияшуда вокунишро ба ҳассосияти баландтари ошкоркунӣ, устувории гармии қавӣ ва таҳаммулпазирии беҳтар медиҳад.

◮ RT-qPCR Осон^TM(Як қадам)-Маҷмӯаи SYBR Green I бо ранги истинодҳои дохилии ROX меояд, ки метавонад барои бартараф кардани заминаҳои сигналӣ ва хатогиҳои сигнал байни чоҳҳо истифода шавад, ки барои муштариён дар моделҳои гуногуни асбобҳои миқдорӣ ПЗР истифода бурдан қулай аст.

RT Осон^TMII (Master Premix барои Синтези аввалини cDNA бароиPCR вақти воқеӣ)

-Қобилияти самараноки хориҷ кардани gDNA, ки метавонад gDNA-ро дар қолаб дар давоми 2 дақиқа хориҷ кунад.

-Системаи самараноки транскрипсияи баръакс, барои анҷом додани синтези риштаи якуми cDNA ҳамагӣ 15 дақиқа вақт лозим аст.

-Шаблонҳои мураккаб: қолабҳои дорои мундариҷаи баланди GC ва сохтори мураккаби дуюмдараҷа низ метавонанд бо самаранокии баланд баргардонида шаванд.

-Системаи транскрипсияи баръакси ҳассосияти баланд, қолибҳои сатҳи pg инчунин метавонанд cDNA-и баландсифат гиранд.

-Системаи транскрипсияи баръакс устувории баланди гармӣ дорад, ҳарорати оптималии реаксия 42 ℃ аст ва он то ҳол дар 50 ℃ иҷрои хуби транскрипсияи баръакс дорад.