PCR (реаксияи занҷири полимеразӣ) яке аз технологияҳои амплификацияи ДНК дар in vitro буда, таърихи зиёда аз 30 сол дорад.

Технологияи PCR аз ҷониби Кари Муллис аз Сетус, ИМА дар соли 1983 пешрав шуда буд. Муллис барои патенти PCR дар соли 1985 муроҷиат кард ва дар ҳамон сол аввалин мақолаи академии PCR-ро оид ба илм нашр кард.Муллис барои кори худ дар соли 1993 ҷоизаи Нобел дар бахши кимиёро гирифт.

Принсипҳои асосии PCR

PCR метавонад порчаҳои ДНК-и мақсаднокро беш аз як миллион маротиба афзоиш диҳад.Принсип зери катализи полимеразаи ДНК буда, ДНК-и риштаи волидайнро ҳамчун қолаб ва праймери мушаххас ҳамчун нуқтаи ибтидоӣ барои васеъ истифода мебарад.Он дар in vitro тавассути қадамҳо ба монанди денатуратсия, тозакунӣ ва васеъшавӣ такрор карда мешавад.Раванди ДНК-и риштаи духтар ба ДНК-и қолаби риштаи волидайн мукаммал аст.

Раванди стандартии PCR ба се марҳила тақсим мешавад:

1.Denaturation: Истифодаи ҳарорати баланд барои ҷудо кардани риштаҳои дукаратаи ДНК.Пайванди гидрогенӣ байни риштаҳои дукаратаи ДНК дар ҳарорати баланд (93-98 ℃) канда мешавад.

2.Тавф кардан: Пас аз ҷудо шудани ДНК-и дуқабата, ҳароратро паст кунед, то праймер ба ДНК-и якқатор пайваст шавад.

3.Extension: Полимеразаи ДНК ба синтез кардани риштаҳои комплементарӣ дар баробари риштаҳои ДНК аз праймерҳои пайвастшуда ҳангоми паст шудани ҳарорат оғоз мекунад.Вақте ки тамдид ба итмом мерасад, давра ба итмом мерасад ва шумораи порчаҳои ДНК дучанд мешавад

Ин се марҳиларо 25-35 маротиба такрор кунед, шумораи пораҳои ДНК ба таври экспоненсиалӣ зиёд мешавад.

Ихтироъкории PCR дар он аст, ки праймерҳои гуногун метавонанд барои генҳои гуногуни мақсаднок тарҳрезӣ шаванд, то пораҳои генҳои мақсаднок дар як муддати кӯтоҳ тақвият дода шаванд.

То ба ҳол, ПЗР-ро ба се категория тақсим кардан мумкин аст, яъне ПЗР оддӣ, ПЗР-и миқдорӣ флуоресцентӣ ва ПЗР рақамӣ.

Насли якуми PCR оддӣ

Барои пурзӯр кардани гени мақсаднок асбоби оддии пурқувваткунии ПТР-ро истифода баред ва сипас электрофорези гели агарозро барои муайян кардани маҳсулот истифода баред, танҳо таҳлили сифатӣ мумкин аст.

Камбудиҳои асосии насли якуми PCR:

1.Моил ба амплификацияи ғайримуқаррарӣ ва натиҷаҳои мусбати бардурӯғ.

2.Муайянкунӣ вақти зиёдро мегирад ва амалиёт душвор аст.

3.Танҳо санҷиши сифатӣ метавонад анҷом дода шавад

Насли дуюми PCR дар вақти воқеӣ

PCR-и воқеии вақт, ки бо номи qPCR низ маъруф аст, зондҳои флуоресцентиро истифода мебарад, ки метавонанд пешрафти системаи реаксияро нишон диҳанд ва ҷамъшавии маҳсулоти пурқувватро тавассути ҷамъшавии сигналҳои флуоресцентӣ назорат мекунанд ва натиҷаҳоро тавассути каҷи флуоресцентҳо доварӣ мекунанд.Онро метавон бо ёрии арзиши Cq ва каҷи стандартӣ муайян кард.

Азбаски технологияи qPCR дар системаи пӯшида амалӣ карда мешавад, эҳтимолияти ифлосшавӣ коҳиш меёбад ва сигнали флуоресцентиро барои муайянкунии миқдорӣ назорат кардан мумкин аст, аз ин рӯ он дар амалияи клиникӣ васеъ истифода мешавад ва ба технологияи бартаридошта дар PCR табдил ёфтааст.

Моддаҳои флуоресцентие, ки дар PCR-и миқдории флуоресцентии вақти воқеӣ истифода мешаванд, метавон ба инҳо тақсим кард: зондҳои флуоресцентии TaqMan, маякҳои молекулавӣ ва рангҳои флуоресцентӣ.

1) Зондҳои флуоресцентии TaqMan:

Ҳангоми амплификацияи PCR, ҳангоми илова кардани як ҷуфт праймер як зондҳои флюоресцентӣ илова карда мешавад.Зонд як олигонуклеотид аст ва ҳарду нӯги он бо гурӯҳи флуорессенти хабарнигор ва гурӯҳи флуоресценти хомӯшкунанда нишон дода шудааст.

Вақте ки зонд солим аст, сигнали флуоресценти аз ҷониби гурӯҳи хабарнигорон баровардашуда аз ҷониби гурӯҳи хомӯшкунӣ ҷаббида мешавад;ҳангоми амплификацияи ПТР, фаъолияти 5′-3′ экзонуклеазаи ферменти Taq зондро мешиканад ва таназзул мекунад ва гурӯҳи флуоресцентии гузоришдиҳанда ва хомӯшкунандаро месозад. Гурӯҳи флуоресцентӣ ҷудо карда мешавад, то системаи назорати флуоресцент метавонад сигнали флуорессенсияро қабул кунад, яъне ҳар дафъае, ки риштаи ДНК пурзӯр мешавад, грипп ва грипп ба вуҷуд меояд, сигнал бо ташаккули маҳсулоти PCR комилан ҳамоҳанг карда мешавад.

2) Ранги флуоресцентии SYBR:

Дар системаи реаксияи PCR зиёда аз ранги флюоресцентии SYBR илова карда мешавад.Пас аз он ки рангҳои флуоресцентии SYBR ба таври мушаххас ба риштаи дукаратаи ДНК дохил карда мешаванд, он сигнали флуоресцентӣ мебарорад.Молекулаи рангҳои SYBR, ки ба занҷир дохил карда нашудааст, ягон сигнали флуоресцентӣ намебарорад ва ба ин васила сигнали флуоресцентиро таъмин мекунад Афзоиши маҳсулоти PCR бо афзоиши маҳсулоти PCR комилан ҳамоҳанг карда мешавад.SYBR танҳо ба ДНК-и дуқабата мепайвандад, аз ин рӯ хати гудохта метавонад барои муайян кардани мушаххас будани реаксияи PCR истифода шавад.

3) Маяки молекулавӣ:

Ин зондҳои олигонуклеотидҳои дукарата бо тамғаи поя, ки дар нӯги 5 ва 3 сохтори мӯи тақрибан 8 пояро ташкил медиҳад.Пайдарпайии кислотаи нуклеинӣ дар ҳарду канори онҳо ба таври иловагӣ ҷуфт карда мешаванд, ки гурӯҳи флуоресцентӣ ва гурӯҳи хомӯшкунандаро сахт мекунанд.Пӯшед, ҳеҷ гуна флуоресцент истеҳсол намешавад.

Пас аз тавлиди маҳсулоти PCR, дар ҷараёни коркард, қисми миёнаи маяки молекулавӣ бо пайдарпаии мушаххаси ДНК ҷуфт карда мешавад ва гени флуоресцентӣ аз гени хомӯшкунанда ҷудо карда мешавад, то флуорессенсияро тавлид кунад.

Камбудиҳои асосии насли дуюми PCR:

Ҳассосият то ҳол вуҷуд надорад ва ошкор кардани намунаҳои нусхабардорӣ нодуруст аст.

Таъсири арзиши замина вуҷуд дорад ва натиҷа ба дахолат ҳассос аст.

Ҳангоме ки дар системаи реаксия ингибиторҳои ПТР мавҷуданд, натиҷаҳои муайянкунӣ ба халалдор мешаванд.

Насли сеюми PCR рақамӣ

PCR рақамӣ (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) рақами нусхаи пайдарпайии ҳадафро тавассути муайянкунии нуқтаи ниҳоӣ ҳисоб мекунад ва метавонад бидуни истифодаи назорати дохилӣ ва каҷҳои стандартӣ муайянкунии дақиқи мутлақи миқдорӣ анҷом диҳад.

ПТР-и рақамӣ муайянкунии нуқтаи ниҳоиро истифода мебарад ва аз арзиши Ct (ҳадди давра) вобаста нест, аз ин рӯ ба реаксияи PCR рақамӣ аз самаранокии амплификация камтар таъсир мерасонад ва таҳаммулпазирӣ ба ингибиторҳои реаксияи PCR бо дақиқии баланд ва такроршавандагӣ беҳтар мешавад.

Аз сабаби хусусиятҳои ҳассосияти баланд ва дақиқии баланд, он аз ҷониби ингибиторҳои реаксияи PCR ба осонӣ халал намерасонад ва он метавонад бидуни маҳсулоти стандартӣ, ки ба нуқтаи доғи тадқиқот ва татбиқ табдил ёфтааст, ба миқдори воқеии мутлақ ноил шавад.

Аз рӯи шаклҳои гуногуни воҳиди реаксия онро ба се намуди асосӣ тақсим кардан мумкин аст: системаҳои микрофлюидӣ, чипӣ ва қатраӣ.

1) PCR рақамии микрофлюидӣ, mdPCR:

Дар асоси технологияи микрофлюидӣ, қолаби ДНК ҷудо карда мешавад.Технологияи микрофлюидӣ метавонад намунаи нано-навсозӣ ё тавлиди қатраҳои хурдро амалӣ кунад, аммо қатраҳо ба усули махсуси адсорбсия ниёз доранд ва сипас бо системаи реаксияи PCR якҷоя карда мешаванд.mdPCR тадриҷан бо усулҳои дигар иваз карда шуд.

2) ПТР рақамӣ дар асоси қатрачаҳо, ddPCR:

Технологияи тавлиди қатраҳои об дар равғанро барои коркарди намуна ба қатраҳо истифода баред ва системаи реаксияи дорои молекулаҳои кислотаи нуклеинро ба ҳазорҳо қатраҳои наномикёс тақсим кунед, ки ҳар кадоми онҳо молекулаи ҳадафи кислотаи нуклеини муайяншавандаро дар бар намегирад ё дорои як то чанд молекулаи ҳадафи кислотаи нуклеинӣ, ки бояд санҷида шаванд, тақсим кунед.

3) PCR рақамӣ дар асоси чип, cdPCR:

Технологияи ҳамгирошудаи роҳи моеъро барои кандакории микротюбҳо ва микрокавитаҳои зиёде дар вафли кремний ё шишаи кварц истифода баред ва ҷараёни маҳлулро тавассути клапанҳои гуногуни назоратӣ назорат кунед ва моеъи намунаро ба нанометрҳои якхела ба чоҳҳои реаксия барои реаксияи рақамии PCR тақсим кунед, то миқдори мутлақро ба даст оред.

Камбудиҳои асосии насли сеюми PCR:

Тачхизоту реактивхо кимат аст.

Талабот ба сифати шаблон баланд аст.Агар миқдори қолиб аз миқдори микросистема зиёд бошад, муайян кардани миқдор ғайриимкон мегардад ва агар он хеле хурд бошад, дурустии миқдор кам мешавад.

Муносибатҳои бардурӯғ инчунин метавонанд ҳангоми тақвияти ғайримуқаррарӣ тавлид шаванд.