RT-qPCR аз технологияи оддии PCR таҳия шудааст.Он ба системаи анъанавии реаксияи PCR моддаҳои кимиёвии флуоресцентӣ (рангҳои флуоресцентӣ ё зондҳои флуоресцентӣ) илова мекунад ва раванди коркарди PCR ва тамдидро дар вақти воқеӣ мувофиқи механизмҳои гуногуни люминесцентии онҳо муайян мекунад.Тағироти сигнали флуоресцентӣ дар муҳити атроф барои ҳисоб кардани миқдори тағирёбии маҳсулот дар ҳар як давраи PCR истифода мешавад.Дар айни замон, усулҳои маъмултарин усули рангкунии флуоресцентӣ ва усули зонд мебошанд.

Усули рангкунии флуоресцентӣ:
Баъзе рангҳои флуоресцентӣ, аз қабили SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO ва ғайра, худ аз худ нур намебароранд, аммо пас аз пайваст шудан ба чуқури хурди dsDNA флуорессенсия медиҳанд.Аз ин рӯ, дар оғози реаксияи PCR, мошин сигнали флуоресцентиро муайян карда наметавонад.Ҳангоме ки реаксия ба марҳилаи васеъшавӣ (усули дуқадам) ё марҳилаи васеъшавӣ (усули сеқадам) мегузарад, дар ин вақт риштаҳои дугона кушода мешаванд ва полимерази нави ДНК Ҳангоми синтези ришта молекулаҳои флуоресцентӣ дар чуқури хурди dsDNA муттаҳид мешаванд ва флуоресцентҳо мебароранд.Бо зиёд шудани шумораи давраҳои PCR, рангҳои бештар ва бештар бо dsDNA пайваст мешаванд ва сигнали флуоресцентӣ низ пайваста такмил меёбад.SYBR Green Ⅰ-ро мисол гиред.
Усули санҷиш:
Зондҳои Такман аз ҳама маъмултарин зондҳои гидролизӣ мебошанд.Дар 5' охири зонд як гурӯҳи флюоресцентӣ мавҷуд аст, одатан FAM.Худи зонд як пайдарпаии иловагии гени мақсаднок мебошад.Дар охири 3'-и флюорофор як гурӯҳи хомӯшкунандаи флуоресцент мавҷуд аст.Мувофиқи принсипи интиқоли энергияи резонанси флуоресцентӣ (Интиқоли энергияи резонанси Förster, FRET), вақте ки гурӯҳи флуоресценти хабарнигор (молекулаи флуоресценти донор) ва гурӯҳи хомӯшкунандаи флуоресцентӣ (молекулаи флуоресценти қабулкунанда) Вақте ки спектри ҳаяҷонангез ба ҳам мепайвандад ва масофаи хеле наздик аст (7-10 м флуорессент), молекулаи аксепторӣ, дар ҳоле ки автофлуоресцентсия заиф мешавад.Аз ин рӯ, дар оғози реаксияи PCR, вақте ки зонд дар система озод ва солим аст, гурӯҳи флуоресценти хабарнигор флуорессенсия намебарорад.Ҳангоми коркард, праймер ва зонд ба қолаб мепайвандад.Дар марҳилаи васеъшавӣ, полимераз пайваста занҷирҳои навро синтез мекунад.ДНК полимераза дорои фаъолияти 5'-3' экзонуклеаза мебошад.Ҳангоми расидан ба зонд, полимеразаи ДНК зондро аз қолаб гидролиз мекунад, гурӯҳи флуоресценти хабарнигорро аз гурӯҳи флуоресценти хомӯшкунанда ҷудо мекунад ва сигнали флуоресцентиро мебарорад.Азбаски байни зонд ва қолаб робитаи як ба як вуҷуд дорад, усули зонд аз ҷиҳати дақиқӣ ва ҳассосияти санҷиш аз усули рангкунӣ бартарӣ дорад.

Расми 1 Принсипи qRT-PCR

Тарҳрезии ибтидоӣ
Принсипҳо:

Примерҳо бояд дар минтақаи ҳифзшудаи силсилаи кислотаи нуклеинӣ тарҳрезӣ шаванд ва хосият дошта бошанд.

Истифодаи пайдарпаии cDNA беҳтар аст ва пайдарпаии mRNA низ қобили қабул аст.Дар акси ҳол, тарҳи минтақаи cds-и пайдарпаии ДНК-ро омӯзед.
Дарозии маҳсулоти миқдории флуоресцентӣ 80-150 бит, дарозтаринаш 300 бит, дарозии ибтидоӣ одатан байни 17-25 пойгоҳ аст ва фарқияти байни примерҳои боло ва поён набояд аз ҳад зиёд калон бошад.

Мазмуни G+C аз 40% то 60% аст ва 45-55% беҳтарин аст.
Арзиши TM дар байни 58-62 дараҷа аст.
Кӯшиш кунед, ки аз димерҳои ибтидоӣ ва худдимерҳо канорагирӣ кунед, (зиёда аз 4 ҷуфт асосҳои пайдарпайи пай дар пай пайдо намешаванд) сохтори мӯй, агар ногузир бошад, ΔG<4.5kJ/mol кунед* Агар шумо боварӣ надоред, ки gDNA ҳангоми транскрипсияи баръакс тоза карда шудааст, беҳтар аст тарҳрезии праймерҳои интронро пешгирӣ кунед, то аз минтақаҳои Trich-и интрон канорагирӣ кунед *3/C, Сохтори пайвастаи A/G (2-3) праймерҳо ва ғайридавлатӣ
мушаххас Гомологияи пайдарпаии ба таври гетерогенӣ пурқувватшуда беҳтараш камтар аз 70% аст ё дорои 8 гомологияи асоси иловагӣ мебошад.
Пойгоҳи додаҳо:
Ҷустуҷӯи CottonFGD аз рӯи калимаҳои калидӣ
Тарҳрезии ибтидоӣ:
Тарҳрезии ибтидоии IDT-qPCR

Fig2 IDT саҳифаи тарроҳии онлайни праймер

Намоиши саҳифаи натиҷа Fig3
Тарҳрезии праймерҳои lncRNA:
lncRNA:ҳамон қадамҳои mRNA.
miRNA:Принсипи усули ҳалқаи бунёдӣ: Азбаски ҳама miRNA-ҳо пайдарпайии кӯтоҳи тақрибан 23 nt мебошанд, муайянкунии мустақими ПТР ғайриимкон аст, аз ин рӯ асбоби пайдарпайии ҳалқа истифода мешавад.Пайдарпаии ҳалқаи поя як ДНК-и якқатораи тақрибан 50 нт мебошад, ки метавонад худ аз худ сохтори мӯи мӯйро ташкил диҳад.3 'Интиҳо метавонад ҳамчун пайдарпаии мукаммалкунандаи порчаи қисман miRNA тарҳрезӣ шавад, пас miRNA-и мақсаднок метавонад ба пайдарпаии ҳалқаи бунёдӣ ҳангоми транскрипсияи баръакс пайваст карда шавад ва дарозии умумӣ метавонад ба 70bp расад, ки ба дарозии маҳсулоти пурқувватшуда, ки аз ҷониби qPCR муайян карда мешавад, мувофиқат мекунад.Тарҳрезии ибтидоии miRNA.
Муайянкунии мушаххаси амплификация:
Пойгоҳи онлайни таркиш: Таркиши CottonFGD аз рӯи шабоҳати пайдарпай
Таркишҳои маҳаллӣ: Ба истифодаи Blast+ барои анҷом додани таркиши маҳаллӣ муроҷиат кунед, linux ва macos метавонанд мустақиман пойгоҳи маҳаллӣ таъсис диҳанд, системаи win10 низ метавонад пас аз насби ubuntu bash анҷом дода шавад.Эҷоди базаи таркишҳои маҳаллӣ ва таркиши маҳаллӣ;Ubuntu bash -ро дар win10 кушоед.
Эзоҳ: Пахтазори кӯҳӣ ва пахтаи ҷазираи баҳрӣ зироатҳои тетраплоид мебошанд, аз ин рӯ натиҷаи таркиш аксар вақт ду ё зиёда мувофиқат хоҳад буд.Дар гузашта, истифодаи CD-ҳои NAU ҳамчун пойгоҳи додаҳо барои анҷом додани таркиш эҳтимолан ду гени гомологиро бо танҳо чанд фарқияти SNP пайдо кунад.Одатан, ду генҳои гомологиро бо тарҳи ибтидоӣ ҷудо кардан мумкин нест, аз ин рӯ ба онҳо якхела муносибат мекунанд.Агар индел аён бошад, праймер одатан дар индел тарҳрезӣ мешавад, аммо ин метавонад ба сохтори дуюмдараҷаи праймер оварда расонад. Энергияи озод баландтар мешавад, ки боиси паст шудани самаранокии пурқувват мегардад, аммо ин ногузир аст.

Муайян кардани сохтори дуюмдараҷаи ибтидоӣ:
Қадамҳо:oligo 7-ро кушоед → пайдарпаии қолаби воридшавӣ → пӯшидани зерравзанаи → захира кунед → ҷойгиркунии праймер дар қолаб, ctrl+D-ро пахш кунед то дарозии праймерро муқаррар кунед → сохторҳои гуногуни дуюмдараҷаро таҳлил кунед, ба монанди бадани худдимеризатсия, гетеродимер, мӯй, номувофиқӣ ва ғайра. Ду расми охирин дар расми 4 натиҷаҳои санҷиши праймерҳо мебошанд.Натиҷаи ибтидоии пеш хуб аст, сохтори dimer ва мӯйҳои возеҳ нест, пойгоҳҳои доимии иловагӣ вуҷуд надорад ва арзиши мутлақи энергияи озод аз 4,5 камтар аст, дар ҳоле ки праймери қафо пайваста нишон медиҳад.гайр аз ин, дар охири 3′ димери чиддитар пайдо мешавад ва димери 4 пояи пай дар пай пайдо мешавад.Гарчанде ки энергияи озод баланд нест, 3′ dimer Chl метавонад ба хусусияти амплификация ва самаранокии пурқувват таъсир расонад.Илова бар ин, барои тафтиш кардани мӯйҳо, гетеродимерҳо ва номувофиқӣ зарур аст.

Натоиҷи ошкоркунии Fig3 oligo7
Муайян кардани самаранокии тақвият:
Самаранокии пурқувваткунии реаксияи PCR ба натиҷаҳои PCR ба таври ҷиддӣ таъсир мерасонад.Инчунин дар qRT-PCR, самаранокии амплификация барои натиҷаҳои миқдорӣ махсусан муҳим аст.Дигар моддаҳо, мошинҳо ва протоколҳоро дар буфери реаксия хориҷ кунед.Сифати праймерҳо инчунин ба самаранокии пурқувваткунии qRT-PCR таъсири калон мерасонад.Барои таъмини дақиқии натиҷаҳо, ҳам миқдорбандии нисбии флуорессенсия ва ҳам миқдори мутлақи флуорессенсия бояд самаранокии амплификацияи праймерҳоро муайян кунанд.Эътироф шудааст, ки самаранокии пурқувваткунии qRT-PCR аз 85% то 115% аст.Ду усул вуҷуд дорад:
1. Усули каҷи стандартӣ:
а.Омезиши cDNA
б.Раванди градиент
c.qPCR
г.Муодилаи регрессияи хатӣ барои ҳисоб кардани самаранокии пурқувват
2. LinRegPCR
LinRegPCR як барнома барои таҳлили маълумотҳои RT-PCR дар вақти воқеӣ мебошад, ки онро маълумоти миқдорӣ (qPCR) дар асоси SYBR Green ё химияи шабеҳ низ меноманд.Барнома маълумоти ислоҳшудаи ғайри асосиро истифода мебарад, ислоҳи асосиро дар ҳар як намуна алоҳида иҷро мекунад, равзанаи хатиро муайян мекунад ва сипас таҳлили регрессияи хатиро барои мувофиқ кардани хати рост тавассути маҷмӯи додаҳои PCR истифода мебарад.Аз нишебии ин хат самаранокии PCR-и ҳар як намунаи алоҳида ҳисоб карда мешавад.Самаранокии миёнаи PCR барои як ампликон ва арзиши Ct барои як намуна барои ҳисоб кардани консентратсияи ибтидоӣ дар як намуна истифода мешавад, ки бо воҳидҳои флуорессенси худсарона ифода шудааст.Ворид ва баромади маълумот тавассути ҷадвали Excel сурат мегирад.Танҳо намуна
омехта кардан лозим аст, градиент нест
қадамҳо лозиманд:(Барои мисол Bole CFX96-ро гиред, на он қадар мошин бо ABI равшан)
озмоиш:он як таҷрибаи стандартии qPCR аст.
Натиҷаи маълумоти qPCR:LinRegPCR метавонад ду шакли файлҳои баромадро эътироф кунад: RDML ё натиҷаи ченкунии миқдорӣ.Дарвоқеъ, ин арзиши муайянкунии вақти воқеии рақами давра ва сигнали флуорессенсия аз ҷониби мошин аст ва амплификация тавассути таҳлили арзиши тағирёбии флуорессенси самаранокии сегменти хатӣ ба даст оварда мешавад.
Интихоби маълумот: Дар назария, арзиши RDML бояд қобили истифода бошад.Тахмин меравад, ки мушкилоти компютери ман дар он аст, ки нармафзор RDML-ро эътироф карда наметавонад, аз ин рӯ ман арзиши баромади Excelро ҳамчун маълумоти аслӣ дорам.Тавсия дода мешавад, ки аввал скрининги ноҳамвори маълумотро анҷом диҳед, ба монанди нокомии илова кардани намунаҳо ва ғайра. Нуқтаҳоро дар маълумоти баромад нест кардан мумкин аст (албатта, шумо онҳоро нест карда наметавонед, LinRegPCR дар марҳилаи баъдӣ ин нуқтаҳоро нодида мегирад)

Fig5 содироти маълумот qPCR

Fig6 интихоби намунаҳои номзад

Вуруди маълумот:Ampplification qualification results.xls-ро кушоед, → LinRegPCR-ро кушоед → файл → аз Excel хонед → параметрҳоро тавре ки дар расми 7 нишон дода шудааст → Хуб → муайян кардани хатҳои асосӣ -ро пахш кунед

Fig7 қадамҳои вуруди маълумот linRegPCR

Натиҷа:Агар такрор набошад, гурӯҳбандӣ талаб карда намешавад.Агар такрор вуҷуд дошта бошад, гурӯҳбандиро дар гурӯҳбандии намунавӣ таҳрир кардан мумкин аст ва номи ген дар идентификатор ворид карда мешавад ва он гоҳ ҳамон ген ба таври худкор гурӯҳбандӣ мешавад.Дар ниҳоят, файлро клик кунед, excel-ро содир кунед ва натиҷаҳоро бубинед.Самаранокии пурқувваткунӣ ва натиҷаҳои R2 дар ҳар як чоҳ намоиш дода мешавад.Дуюм, агар шумо ба гурӯҳҳо тақсим кунед, самаранокии миёнаи ислоҳшуда нишон дода мешавад.Боварӣ ҳосил кунед, ки самаранокии тақвияти ҳар як праймер аз 85% то 115% аст.Агар он хеле калон ё хеле хурд бошад, ин маънои онро дорад, ки самаранокии амплификацияи праймер паст аст.

Расми 8 Натиҷа ва баромади маълумот

Раванди таҷрибавӣ:
Талабот ба сифати RNA:
тозагӣ:1.72.0 нишон медиҳад, ки изотиоцианати боқимонда вуҷуд дорад.Кислотаи нуклеини тозаи A260/A230 бояд тақрибан 2 бошад.Илова бар ин, онро тавассути электрофорези 1,5% агарози гелӣ муайян кардан мумкин аст.Нишондиҳандаро нишон диҳед, зеро ssRNA денатуратсия надорад ва логарифми вазни молекулавӣ муносибати хатӣ надорад ва вазни молекулавӣ дуруст ифода карда намешавад.Консентратсия: аз ҷиҳати назариявӣнекамтар аз 100нг/ул, агар консентратсияи хеле паст бошад, тозагӣ умуман паст аст, на баланд

Fig9 РНК гел

Илова бар ин, агар намуна қиматбаҳо бошад ва консентратсияи РНК баланд бошад, тавсия дода мешавад, ки онро пас аз истихроҷ аликвот кунед ва РНК-ро то консентратсияи ниҳоии 100-300 нг/ул барои транскрипсияи баръакс ҳал кунед.Дарраванди транскрипсияи баръакс, вақте ки mRNA транскрипт карда мешавад, барои транскрипсияи баръакс праймерҳои олиго (dt) истифода мешаванд, ки метавонанд ба думҳои polyA махсус пайваст шаванд, дар ҳоле ки lncRNA ва circRNA праймерҳои тасодуфии гексамерро (Тасодуфӣ 6 mer) барои транскрипсияи баръакси РНК Барои miRNA истифода мебаранд, барои миРНК, примерҳои рескрипти мушаххаси neckloopn истифода мешаванд.Холо бисьёр корхонахо комплектхои махсуси хошоктайёркуниро ба кор андохтаанд.Барои усули ҳалқаи поя, усули думдоркунӣ қулайтар, иқтидори баланд ва сарфакунандаи реактив аст, аммо Таъсири фарқ кардани miRNA-ҳои як оила набояд мисли усули ҳалқаи бунёдӣ хуб бошад.Ҳар як маҷмӯаи транскрипсияи баръакс барои консентратсияи праймерҳои мушаххаси ген (халқҳои поя) талабот дорад.Истиноди дохилӣ барои miRNA истифода мешавад U6.Дар ҷараёни инверсияи поя-халқа, як найчаи U6 бояд алоҳида иваз карда шавад ва праймерҳои пеш ва пушти U6 мустақиман илова карда шаванд.Ҳам circRNA ва ҳам lncRNA метавонанд HKG-ро ҳамчун истинодҳои дохилӣ истифода баранд.Дарошкор cDNA,
агар бо РНК мушкилот надошта бошад, cDNA низ бояд хуб бошад.Аммо, агар такмил додани таҷриба пайгирӣ карда шавад, беҳтар аст, ки гени истинодҳои дохилӣ (Reference gen, RG) истифода шавад, ки метавонад gDNA-ро аз CD-ҳо фарқ кунад.Умуман, RG як гени хонагӣ аст., HKG) тавре ки дар расми 10 нишон дода шудааст;Он вақт ман протеини нигоҳдории лӯбиёро тайёр мекардам ва ҳамчун истинод дар дохили актин7, ки интрон дорад, истифода мебурдам.Андозаи порчаи пурқувватшудаи ин праймер дар gDNA 452bp буд ва агар cDNA ҳамчун қолаб истифода мешуд, он 142bp буд.Сипас, натиҷаҳои санҷиш муайян карданд, ки қисми cDNA воқеан бо gDNA олуда шудааст ва он инчунин собит кард, ки дар натиҷаи транскрипсияи баръакс мушкилот вуҷуд надорад ва он метавонад ҳамчун қолаби PCR истифода шавад.Бевосита бо cDNA электрофорези агарози гелӣ гузаронидан бефоида аст ва он як банди паҳншуда аст, ки боварибахш нест.

Расми 10 Муайянкунии cDNA

Муайян кардани шартҳои qPCRаст, умуман ҳеҷ мушкиле тибқи протоколи маҷмӯа, асосан дар қадами арзиши tm.Агар баъзе праймерҳо ҳангоми тарҳрезии праймер хуб тарҳрезӣ нашуда бошанд, ки дар натиҷа байни арзиши tm ва 60°C назариявӣ фарқияти калон ба вуҷуд меояд, тавсия дода мешавад, ки cDNA Пас аз омехта шудани намунаҳо, градиенти ПТР-ро бо праймерҳо иҷро кунед ва кӯшиш кунед, ки ҳароратро бидуни бандҳо ҳамчун арзиши TM муқаррар кунед.

Таҳлили маълумот

Усули анъанавии коркарди миқдорӣ аз флуорессенси нисбии PCR асосан аз рӯи 2-ΔΔCT.Шаблони коркарди маълумот.

Маҳсулоти марбут:

Дар вақти воқеӣ PCR осон^TM – Тақман

Дар вақти воқеӣ PCR осон^TM -Сибр ГРИН И

RT Easy I (Master Premix барои синтези аввалини cDNA)

RT Easy II (Master Premix барои синтези аввалини cDNA барои qPCR)