一、 Баланд бардоштани ҳассосияти системаи реаксия:

1. РНК-и баландсифатро ҷудо кунед:

Синтези бомуваффақияти cDNA аз РНК-и баландсифат меояд.РНК-и баландсифат бояд ҳадди аққал дарозии пурра дошта бошад ва аз ингибиторҳои транскриптазаи баръакс ба монанди EDTA ё SDS озод бошад.Сифати РНК миқдори максималии иттилооти пайдарпайро, ки шумо метавонед ба cDNA интиқол диҳед, муайян мекунад.Усули маъмули тозакунии РНК як усули якқадам бо истифода аз изотиоцианати гуанидин / фенол кислота мебошад.Барои пешгирии ифлосшавӣ бо миқдори микроэлементҳои RNase, РНК-и аз намунаҳои бойи RNase ҷудошуда (масалан, гадуди зери меъда) бояд дар формальдегид нигоҳ дошта шавад, то РНК-и баландсифат, махсусан барои нигоҳдории дарозмуддат нигоҳ дошта шавад.РНК-и аз ҷигари каламуш истихроҷшуда пас аз як ҳафта дар об нигоҳ доштан асосан таназзул шуд, дар ҳоле ки РНК аз испурч гирифташуда пас аз 3 сол дар об нигоҳ доштан устувор монд.Илова бар ин, транскриптҳои дарозиашон аз 4 кб нисбат ба транскриптҳои хурд ба таназзул тавассути RNases пайгирӣ ҳассостаранд.Барои баланд бардоштани устувории намунаҳои захирашудаи РНК, РНК-ро дар формамиди деионизатсияшуда гудохтан ва дар -70°C нигоҳ доштан мумкин аст.Формамиде, ки барои нигоҳ доштани РНК истифода мешавад, бояд аз партовҳои таназзулкунандаи РНК холӣ бошад.РНК-и гадуди зери меъда метавонад дар формамид на камтар аз як сол нигоҳ дошта шавад.Ҳангоми тайёрӣ ба истифодаи РНК, шумо метавонед усули зерини преципиципатсияи РНК-ро истифода баред: NaCl-ро ба 0,2М ва 4 маротиба ҳаҷми этанол илова кунед, дар ҳарорати хонагӣ барои 3-5 дақиқа ҷойгир кунед ва дар 10000 × г 5 дақиқа центрифуга кунед.

2. Транскриптазаи баръакси RNaseH- ғайрифаъол (RNaseH-) -ро истифода баред:

Ингибиторҳои RNase аксар вақт ба реаксияҳои баръакси транскрипсия барои зиёд кардани дарозӣ ва ҳосили синтези cDNA илова карда мешаванд.Ингибиторҳои RNase бояд ҳангоми реаксияи синтези риштаи якум дар ҳузури буфер ва агенти коҳишдиҳанда (масалан, DTT) илова карда шаванд, зеро раванди пеш аз синтези cDNA ингибиторро денатуратсия мекунад ва ба ин васила РНази алоқамандро ҷудо мекунад, ки метавонад РНК-ро вайрон кунад.Ингибиторҳои протеини RNase танҳо таназзули РНК-ро тавассути RNase A, B, C пешгирӣ мекунанд ва RNase-ро дар пӯст пешгирӣ намекунанд, аз ин рӯ эҳтиёт шавед, ки сарфи назар аз истифодаи ин ингибиторҳо RNase-ро аз ангуштони худ ворид накунед.

Транскриптазаи баръакс табдили РНК-ро ба cDNA катализ мекунад.Ҳарду M-MLV ва AMV ба ғайр аз фаъолияти полимеразии худ фаъолияти эндогении RNaseH доранд.Фаъолияти RNaseH ва фаъолияти полимераз барои риштаи гибридии байни қолаби РНК ва праймери ДНК ё риштаи васеъшавии cDNA ташаккулёфта бо ҳамдигар рақобат мекунанд ва риштаи РНК-ро дар комплекси RNA:DNA таназзул мекунанд.Шаблони РНК, ки бо фаъолияти RNaseH вайрон шудааст, дигар наметавонад ҳамчун субстрати муассир барои синтези cDNA хидмат кунад, ки ҳосил ва дарозии синтези cDNA-ро коҳиш медиҳад.Аз ин рӯ, бартараф кардан ё хеле кам кардани фаъолияти RNaseH-и транскриптазаи баръакс муфид хоҳад буд.

SuperScript Ⅱ транскриптазаи баръакс, RNaseH- MMLV транскриптазаи баръакс ва термоскриптаза, RNaseH- AMV, метавонад нисбат ба MMLV ва AMV миқдори бештар ва пурратар cDNA ба даст орад.Ҳассосияти RT-PCR ба миқдори синтези cDNA таъсир мерасонад.ThermoScript нисбат ба AMV хеле ҳассостар аст.Андозаи маҳсулоти RT-PCR бо қобилияти транскриптазаи баръакс барои синтез кардани cDNA маҳдуд аст, махсусан ҳангоми клон кардани cDNA-ҳои калонтар.Дар муқоиса бо MMLV, SuperScripⅡ ҳосили маҳсулоти дарозмуддати RT-PCR-ро ба таври назаррас афзоиш дод.Транскриптази баръакси RNaseH низ термостабилиятро зиёд кардааст, бинобар ин реаксияро дар ҳарорати баландтар аз муқаррарӣ 37-42°C иҷро кардан мумкин аст.Дар шароити пешниҳодшудаи синтез, олиго(dT) праймер ва 10 μCi [α-P]dCTP-ро истифода баред.Ҳосили умумии риштаи якум бо усули боришоти TCA ҳисоб карда шуд.cDNA-и пурраи дарозӣ бо истифода аз бандҳои аз рӯи андоза ҷудошуда таҳлил карда шуд ва дар гели агарози сілтӣ ҳисоб карда шуд.

3. Баланд бардоштани ҳарорати инкубатсия барои транскрипсияи баръакс:

Ҳарорати баландтари инкубатсия барои кушодани сохтори дуюмдараҷаи РНК кӯмак мекунад ва ҳосили реаксияро зиёд мекунад.Барои аксари қолибҳои РНК, инкубатсия кардани РНК ва праймерҳо дар ҳарорати 65°C бидуни буфер ё намак, пас аз сардшавии босуръат дар ях аксари сохторҳои дуюмдараҷаро нест мекунад ва имкон медиҳад, ки праймерҳо пайваст шаванд.Аммо, баъзе шаблонҳо ҳатто пас аз денатуратсияи гармӣ сохторҳои дуюмдараҷа доранд.Амплификатсияи ин қолибҳои душворро метавон бо истифода аз ThermoScript Reverse Transkriptase анҷом дод ва реаксияи транскрипсияи баръаксро дар ҳарорати баландтар барои беҳтар кардани амплификатсия ҷойгир кард.Ҳарорати баландтари инкубатсия инчунин метавонад хосиятро зиёд кунад, хусусан вақте ки праймерҳои хоси ген (GSP) барои синтези cDNA истифода мешаванд (ниг. Боби 3).Ҳангоми истифодаи GSP, боварӣ ҳосил кунед, ки Tm-и праймерҳо бо ҳарорати интизории инкубатсия яксон аст.Олиго(dT) ва праймерҳои тасодуфӣ аз 60°C боло истифода набаред.Примерҳои тасодуфӣ инкубатсияро дар 25 ° C барои 10 дақиқа пеш аз он ки то 60 ° C зиёд кунанд, талаб мекунанд.Илова ба истифодаи ҳарорати баландтари транскрипсияи баръакс, хосиятро инчунин тавассути интиқоли мустақими омехтаи РНК/праймер аз ҳарорати денатуратсияи 65°C ба ҳарорати инкубатсияи баръакси транскрипсия ва илова кардани омехтаи реаксияи қаблан гармшудаи 2× (синтези гарми оғози cDNA) беҳтар кардан мумкин аст.Ин равиш ба пешгирии ҷуфтшавии байнимолекулярӣ, ки дар ҳарорати паст рух медиҳад, кӯмак мекунад.Гузариши чандкаратаи ҳароратро, ки барои RT-PCR лозим аст, бо истифода аз сикли гармидиҳӣ содда кардан мумкин аст.

Tth полимеразаи термостабли ҳамчун полимеразаи ДНК дар ҳузури Mg2+ ва ҳамчун полимеразаи РНК дар ҳузури Mn2+ амал мекунанд.Онро дар ҳарорати ҳадди аксар 65 ° C гарм нигоҳ доштан мумкин аст.Бо вуҷуди ин, мавҷудияти Mn2+ ҳангоми PCR садоқатмандиро коҳиш медиҳад, ки полимерази Tth-ро барои тақвияти дақиқи баланд, ба монанди клонкунии cDNA камтар мувофиқ мекунад.Илова бар ин, Tth дорои самаранокии пасти транскрипсияи баръакс мебошад, ки ҳассосиятро коҳиш медиҳад ва азбаски транскрипсияи баръакс ва PCR метавонад бо як фермент иҷро карда шавад, реаксияҳои назорат бидуни транскрипсияи баръакс барои муқоисаи маҳсулоти амплификацияи cDNA бо ДНК-и геномии ифлоскунанда истифода намешаванд.Маҳсулоти пурқувват ҷудо карда шуданд.

4. Иловаҳо, ки ба транскрипсияи баръакс мусоидат мекунанд:

Ба реаксияи синтези риштаи якум иловаҳо, аз ҷумла глицерол ва DMSO илова карда мешаванд, ки метавонанд устувории дуқабати кислотаи нуклеинро коҳиш диҳанд ва сохтори дуввуми РНК-ро кушоянд.То 20% глицерол ё 10% DMSO метавонад бидуни таъсир ба фаъолияти SuperScript II ё MMLV илова карда шавад.AMV инчунин метавонад то 20% глицеролро бидуни гум кардани фаъолият таҳаммул кунад.Барои баланд бардоштани ҳассосияти RT-PCR дар реаксияи транскрипсияи баръакси SuperScriptⅡ, 10% глицеролро илова кардан мумкин аст ва дар 45°С инкубатсия карда мешавад.Агар ба ПТР 1/10 мањсули реаксияи транскрипсияи баръакс илова карда шавад, он гоњ консентратсияи глицерин дар реаксияи амплификация 0,4% -ро ташкил медињад, ки барои боздоштани ПТР кифоя нест.

5. Табобати RNaseH:

Табобати реаксияҳои синтези cDNA бо RNaseH пеш аз PCR метавонад ҳассосиятро зиёд кунад.Барои баъзе шаблонҳо, чунин мешуморанд, ки РНК дар реаксияи синтези cDNA пайвастшавии маҳсулоти амплификацияро пешгирӣ мекунад, дар ин ҳолат табобати RNaseH метавонад ҳассосиятро зиёд кунад.Умуман, табобати RNaseH ҳангоми пурзӯр кардани қолибҳои дарозмуддати ҳадафи cDNA, ба монанди скерози туберозӣ II, зарур аст.Барои ин қолаби душвор, табобати RNaseH сигналеро, ки аз ҷониби SuperScript II ё cDNA-синтезшудаи AMV истеҳсол шудааст, такмил дод.Барои аксари аксуламалҳои RT-PCR, табобати RNaseH ихтиёрӣ аст, зеро қадами денатуратсияи ПТР дар 95°C умуман РНК-ро дар комплекси РНК:ДНК гидролиз мекунад.

6. Такмили усули муайянкунии РНК хурд:

RT-PCR махсусан ҳангоми мавҷуд будани миқдори ками РНК душвор аст.Гликоген ҳамчун интиқолдиҳанда ҳангоми ҷудокунии РНК барои баланд бардоштани ҳосили намунаҳои хурд кӯмак мекунад.Гликогени бе RNase метавонад дар як вақт бо илова кардани Тризол илова карда шавад.Гликоген дар об ҳалшаванда аст ва метавонад дар марҳилаи обӣ бо РНК нигоҳ дошта шавад, то ба боришоти минбаъда мусоидат кунад.Барои намунаҳои камтар аз 50 мг бофта ё 106 ҳуҷайраҳои парваришшуда, консентратсияи тавсияшудаи гликогени бидуни RNase 250 мкг / мл аст.

Илова кардани BSA-и ацетилизатсияшуда ба реаксияи транскрипсияи баръакс бо истифода аз SuperScript II метавонад ҳассосиятро зиёд кунад ва барои миқдори ками РНК, кам кардани миқдори SuperScript II ва илова кардани 40 воҳиди ингибитори нуклеаза RNaseOut метавонад сатҳи ошкоркуниро баланд бардорад.Агар гликоген дар раванди ҷудокунии РНК истифода шавад, ба ҳар ҳол тавсия дода мешавад, ки BSA ё ингибитори RNase ҳангоми истифодаи SuperScript II барои реаксияи транскрипсияи баръакс илова кунед.

二、 Баланд бардоштани хосияти RT-PCR

1. Асинтези CND:

Синтези аввалини cDNA-ро бо истифода аз се усули гуногун оғоз кардан мумкин аст, ки хосияти нисбии онҳо ба миқдор ва намуди cDNA-и синтезшуда таъсир мерасонад.

Усули ибтидоии тасодуфӣ аз се усул камтар мушаххас буд.Праймерҳо дар сайтҳои гуногун дар тӯли транскрипт об мешаванд ва cDNA-ҳои кӯтоҳ ва қисман дарозиро тавлид мекунанд.Ин усул аксар вақт барои ба даст овардани пайдарпаии охири 5' ва ба даст овардани cDNA аз қолибҳои РНК бо минтақаҳои сохтори дуюмдараҷа ё маконҳои хотимавӣ, ки бо транскриптазаи баръакс такрор карда намешаванд, истифода мешавад.Барои ба даст овардани дарозтарин cDNA, таносуби праймерҳо ба РНК дар ҳар як намунаи РНК бояд ба таври эмпирикӣ муайян карда шавад.Консентратсияи ибтидоии праймерҳои тасодуфӣ аз 50 то 250 нг дар як реаксияи 20 мкл буд.Азбаски cDNA аз умумии РНК бо истифода аз праймерҳои тасодуфӣ синтез карда мешавад, асосан РНК-и рибосомӣ мебошад, одатан поли(А)+РНК ҳамчун қолаб интихоб карда мешавад.

Примерҳои Oligo(dT) нисбат ба праймерҳои тасодуфӣ мушаххастаранд.Он ба думи поли(А), ки дар охири 3′-и аксари mRNA-ҳои эукариотӣ мавҷуд аст, гибрид мешавад.Азбаски поли(А)+ РНК тақрибан аз 1% то 2% РНК-и умумиро ташкил медиҳад, миқдор ва мураккабии cDNA нисбат ба праймерҳои тасодуфӣ хеле камтар аст.Аз сабаби хусусияти баланди худ, олиго (dT) одатан оптимизатсияи таносуби РНК ба праймерҳо ва интихоби поли(А)+-ро талаб намекунад.Тавсия дода мешавад, ки барои як системаи реаксияи 20 мкл 0,5 мкг олиго (дТ) истифода шавад.oligo(dT)12-18 барои аксари RT-PCR мувофиқ аст.Системаи ThermoScript RT-PCR oligo(dT)20-ро аз сабаби устувории гармии беҳтараш барои ҳарорати баландтари инкубатсия пешниҳод мекунад.

Примерҳои мушаххаси ген (GSP) примерҳои мушаххастарин барои қадами транскрипсияи баръакс мебошанд.GSP як олигонуклеотиди антисенсе мебошад, ки ба таври махсус метавонад ба пайдарпаии ҳадафи РНК гибридизатсия карда шавад, бар хилофи праймерҳои тасодуфӣ ё олиго (dT), ки ба ҳама РНКҳо пайваст мешаванд.Ҳамин қоидаҳое, ки барои тарҳрезии праймерҳои PCR истифода мешаванд, ба тарҳрезии GSP дар реаксияҳои транскрипсияи баръакс татбиқ мешаванд.GSP метавонад ҳамон пайдарпаии праймери пурқувваткунанда бошад, ки ба 3'-аз ҳама охири mRNA пайваст мешавад ё GSP метавонад барои коркарди поёни праймери пурқувваткунандаи баръакс тарҳрезӣ шавад.Барои баъзе субъектҳои пурқувватшуда, бояд барои бомуваффақияти RT-PCR зиёда аз як праймерҳои антисенс тарҳрезӣ шаванд, зеро сохтори дуюмдараҷаи РНК-и мақсаднок метавонад пайвастшавии праймерро пешгирӣ кунад.Тавсия дода мешавад, ки 1 pmol антисенси GSP дар реаксияи синтези риштаи якум 20 мкл истифода шавад.

2. Баланд бардоштани ҳарорати инкубатсия барои транскрипсияи баръакс:

Барои пурра истифода бурдани бартарии пурраи хосияти GSP, бояд транскриптазаи баръакс бо термостатии баландтар истифода шавад.Транскриптазаҳои баръакси термостабиро дар ҳарорати баландтар инкубатсия кардан мумкин аст, то шиддатнокии реаксияро зиёд кунад.Масалан, агар GSP дар ҳарорати 55°С гарм шавад, хусусияти GSP пурра истифода намешавад, агар AMV ё M-MLV барои транскрипсияи баръакс дар шиддати пасти 37°C истифода шавад.Бо вуҷуди ин, SuperScript II ва ThermoScript метавонанд дар ҳарорати 50°C ё баландтар реаксия карда шаванд, ки ин маҳсулоти ғайримуқаррариро, ки дар ҳарорати паст тавлид мешаванд, нест мекунад.Барои хосияти максималӣ, омехтаи РНК/праймерро метавон мустақиман аз ҳарорати денатуратсияи 65°C ба ҳарорати инкубатсияи баръакси транскрипсия интиқол дод ва ба омехтаи реаксияи қаблан гармшудаи 2× (оғози гарми синтези cDNA) илова кард.Ин барои пешгирӣ кардани ҷуфтшавии байнимолекулаҳо дар ҳарорати паст кӯмак мекунад.Гузаришҳои сершумори ҳароратро, ки барои RT-PCR лозим аст, бо истифода аз сикли гармидиҳӣ содда кардан мумкин аст.

3. Ифлосшавии геномии ДНК-ро коҳиш медиҳад:

Мушкилоти эҳтимолӣ бо RT-PCR ин ифлосшавии ДНК-и геномӣ дар РНК мебошад.Истифодаи усули хуби ҷудокунии РНК, ба монанди Trizol Reagent, миқдори ДНК-и геномии ифлоскунандаи маводи РНК-ро коҳиш медиҳад.Барои пешгирӣ кардани маҳсулоте, ки аз ДНК-и геномӣ гирифта шудааст, РНК-ро метавон бо дараҷаи амплификацияи DNase I табобат кард, то ДНК-и ифлоскунандаро пеш аз транскрипсияи баръакс хориҷ кунад.Ҳазми DNase I тавассути инкубатсияи намунаҳо дар 2,0 мм EDTA барои 10 дақиқа дар 65 ° C қатъ карда шуд.EDTA метавонад ионҳои магнийро хелат карда, гидролизи РНК-и аз магний вобастаро дар ҳарорати баланд пешгирӣ кунад.

Барои ҷудо кардани cDNA-и пурқувватшуда аз ифлоскунандаи маҳсулоти амплификацияи геномии ДНК, праймерҳоро тарҳрезӣ кардан мумкин аст, ки ҳар яки онҳо барои ҷудо кардани экзонҳо ҷудо карда шаванд.Маҳсулоти ПТР, ки аз cDNA гирифта шудаанд, назар ба маҳсулоти аз ДНК-и геномии олудашуда кӯтоҳтар хоҳад буд.Илова бар ин, дар ҳар як қолаби РНК озмоиши назоратӣ бидуни транскрипсияи баръакс гузаронида шуд, то муайян кунад, ки оё порчаи додашуда аз ДНК геномӣ ё cDNA гирифта шудааст.Маҳсулоти PCR, ки бидуни транскрипсияи баръакс ба даст оварда шудааст, аз геном гирифта мешавад.