Ⅰ. Баланд бардоштани ҳассосияти системаи реаксия:

1. РНК-и баландсифатро ҷудо кунед:

Синтези бомуваффақияти cDNA аз РНК-и баландсифат ба даст меояд.РНК-и баландсифат бояд ҳадди аққал муддати тӯлониро таъмин кунад ва дорои ингибиторҳое набошад, ки ферментҳои сабткунанда, ба монанди EDTA ё SDS надоранд.Сифати РНК арзиши максималии иттилооти пайдарпайро, ки шумо метавонед ба cDNA интиқол диҳед, муайян мекунад.Усули умумии тозакунии РНК як усули қадами истифодаи изооцианат/ацидофенол мебошад.Барои пешгирии ифлосшавии RNase, РНК аз намунае, ки аз RNase бой аст (масалан, гадуди зери меъда) ҷудо карда шудааст, барои нигоҳ доштани РНК-и баландсифат нигоҳдории формальдегидро талаб мекунад, ки ин барои нигоҳдории дарозмуддат бештар аст.РНК-и аз ҷигари каламуш истихроҷшуда асосан пас аз як ҳафта нигоҳдорӣ дар об таназзул шуд, дар ҳоле ки РНК аз испурч гирифташуда пас аз се соли нигоҳдорӣ дар об устувор монд.Илова бар ин, транскриптҳои аз 4 кб калонтар нисбат ба транскриптҳои хурд ба таназзули RNase ҳассостаранд.Бо мақсади баланд бардоштани устувории намунаи нигоҳдории РНК, РНК-ро дар як метальмамини ион гудохтан мумкин аст ва дар -70 °C нигоҳ дошта мешавад.Тилиди, ки барои захира кардани РНК истифода мешавад, набояд дорои ашёи гуногуне бошад, ки РНК-ро вайрон мекунад.РНК, ки аз гадуди зери меъда гирифта мешавад, дар метальмамин ҳадди аққал як сол нигоҳ дошта мешавад.Вақте ки шумо ба истифодаи РНК омодаед, шумо метавонед усулҳои зеринро барои преципиципатсияи РНК истифода баред: NaCl-ро ба 0,2м ва 4 маротиба миқдори этанол илова кунед, дар ҳарорати хона барои 3-5 дақиқа ҷойгир кунед ва 10,000 × г центрифуга барои 5 дақиқа.

2. Транскриптазаи баръаксро бидуни фаъолияти RNaseH (RNaseH-) истифода баред:

Ингибиторҳои RNase аксар вақт ба реаксияҳои баръакси транскрипсия барои зиёд кардани дарозӣ ва ҳосили синтези cDNA илова карда мешаванд.Ингибитори RNase дар реаксияи аввалини синтези занҷир дар ҳузури буферҳо ва агентҳои коҳишдиҳанда ба монанди DTT илова карда мешавад, зеро раванди синтези пеш аз cDNA ингибиторро денатурат мекунад ва ба ин васила РНазҳои алоқамандро, ки РНК-ро таназзул мекунанд, ҷудо мекунад.Ингибитори протеини RNase танҳо таназзули РНК-ро тавассути RNase A, B, C пешгирӣ мекунад ва RNase дар пӯстро пешгирӣ намекунад, аз ин рӯ эҳтиёт бояд кард, ки сарфи назар аз истифодаи ин ингибиторҳо RNase аз ангуштон ворид карда нашавад.

Транскриптазаи баръакс табдили РНК-ро ба cDNA катализ мекунад.Ҳарду M-MLV ва AMV ба ғайр аз фаъолияти полимеразии худ фаъолияти эндогении RNaseH доранд.Фаъолияти RNaseH бо фаъолияти полимераз барои риштаҳои гетерозигота, ки дар байни қолибҳои РНК ва праймерҳои ДНК ё риштаҳои васеъшавии cDNA ташкил шудаанд, рақобат мекунад ва РНК: риштаҳои РНК-ро дар комплексҳои ДНК вайрон мекунад.Шаблонҳои РНК, ки бо фаъолияти RNaseH вайрон шудаанд, дигар наметавонанд ҳамчун субстратҳои муассир барои синтези cDNA истифода шаванд, ки ҳосил ва дарозии синтези cDNA-ро коҳиш медиҳанд.Ҳамин тариқ, бартараф кардан ё хеле кам кардани фаъолияти RNaseH-и транскриптазаи баръакс фоидаи калон хоҳад дошт.

SuperScriptⅡ транскриптазаи баръакс, транскриптазаи баръакси MMLV аз RNaseH- ва термоскриптаза баръакс, AMV аз RNaseH- назар ба MMLV ва AMV cDNA-и пурратарро дод.Ҳассосияти RT-PCR ба миқдори cDNA-и синтезшуда таъсир мерасонад.ThermoScript нисбат ба AMV хеле ҳассостар аст.Андозаи маҳсулоти RT-PCR бо қобилияти транскриптазаи баръакс барои синтез кардани cDNA маҳдуд аст, махсусан ҳангоми клон кардани Cdnas калонтар.Дар муқоиса бо MMLV, SuperScripⅡ ҳосили маҳсулоти дарозмуддати RT-PCR-ро ба таври назаррас афзоиш дод.Транскриптазаи баръакси RNaseH- инчунин устувории гармиро зиёд мекунад, бинобар ин реаксияро дар ҳарорати баландтар аз муқаррарии 37-42 ℃ гузаронидан мумкин аст.Дар шароити пешниҳодшудаи синтез, праймерҳои олиго (dT) ва 10μCi [alpha-p]dCTP истифода шуданд.Истеҳсоли умумии занҷири якум бо усули боришоти TCA ҳисоб карда шуд.cDNA-и пурраи дарозӣ бо истифода аз хориҷ кардани рахи аз рӯи андоза ҷудошуда ва ҳисоб дар гели агарози сілтӣ таҳлил карда шуд.

3. Баланд бардоштани ҳарорати нигоҳдории гармии транскрипсияи баръакс:

Ҳарорати баландтари нигоҳдорӣ ба кушодани сохтори дуюмдараҷаи РНК ва афзоиши ҳосили реаксия кӯмак мекунад.Барои аксари қолибҳои РНК нигоҳ доштани РНК ва праймер дар 65°С бе буфер ё намак ва сипас зуд хунук кардани онҳо дар болои ях аксари сохторҳои дуюмдараҷаро нест мекунад ва имкон медиҳад, ки праймерҳо пайваст шаванд.Аммо, баъзе қолибҳо ҳатто пас аз денатуратсияи гармӣ сохтори дуюмдараҷа доранд.Амплификатсияи ин қолибҳои душворро метавон бо истифода аз транскриптазаи баръакси ThermoScript ва бо гузоштани реаксияи транскриптазаи баръакс дар ҳарорати баланд барои беҳтар кардани амплификация анҷом дод.Ҳарорати баландтари нигоҳдорӣ инчунин метавонад хосиятро афзоиш диҳад, хусусан вақте ки синтези cDNA бо истифода аз праймерҳои хоси ген (GSPS) анҷом дода мешавад (ниг. Боби 3).Ҳангоми истифодаи GSP, боварӣ ҳосил кунед, ки арзиши Tm-и праймер бо ҳарорати интизории нигоҳдорӣ якхела аст.Олиго (dT) ва праймерҳои тасодуфиро аз 60 ℃ боло истифода набаред.Примерҳои тасодуфӣ бояд дар 25 ℃ барои 10 дақиқа нигоҳ дошта шаванд, то ба 60 ℃ афзоиш диҳанд.Илова ба истифодаи ҳарорати баландтари транскрипсияи баръакс, хосиятро тавассути интиқоли мустақими омехтаи РНК/праймер аз ҳарорати денатуризатсияи 65℃ ба ҳарорати нигоҳдории транскрипсияи баръакс ва илова кардани омехтаи реаксияи қаблан гармшудаи 2 × (синтези оғози гармии cDNA) беҳтар кардан мумкин аст.Ин равиш ба пешгирии ҷуфтшавии байнимолекулярӣ, ки дар ҳарорати паст рух медиҳад, кӯмак мекунад.Истифодаи асбоби PCR бисёр гузаргоҳҳои ҳароратро, ки барои RT-PCR лозиманд, содда мекунад.

Полимеразаи гармии устуворшуда ҳамчун полимеразаи ДНК дар ҳузури Mg2+ ва полимеразаи РНК дар ҳузури Mn2+ амал мекунад.Он метавонад гармиро то 65 ℃ нигоҳ дорад.Бо вуҷуди ин, мавҷудияти Mn2+ ҳангоми PCR садоқатро коҳиш медиҳад, ки полимерази Tth-ро барои тақвияти дақиқи баланд, ба монанди клонкунии cDNA камтар мувофиқ месозад.Илова бар ин, Tth дар транскрипсияи баръакс камтар самаранок аст, ки ҳассосиятро коҳиш медиҳад ва азбаски як фермент метавонад транскрипсияи баръакс ва PCR-ро иҷро кунад, реаксияҳои назоратӣ бидуни транскрипсияи баръакс барои фарқ кардани маҳсулоти пурқувватшудаи cDNA аз маҳсулоти ДНК геномии олудашуда истифода намешаванд.

4. Илова, ки ба транскрипсияи баръакс мусоидат мекунад:

Илова кардани иловаҳо, аз ҷумла глицерин ва DMSO, ба реаксияи якуми синтези занҷир метавонад устувории риштаи дукаратаи кислотаи нуклеинро коҳиш диҳад ва сохтори дуюмдараҷаи РНК-ро кушояд.То 20% глицерин ё 10% DMSO метавонад бе таъсир ба фаъолияти SuperScriptⅡ ё MMLV илова карда шавад.AMV инчунин метавонад то 20% глицеролро бидуни кам кардани фаъолият таҳаммул кунад.Барои ба ҳадди аксар расонидани ҳассосияти RT-PCR дар реаксияи транскрипсияи баръакси SuperScriptⅡ, мумкин аст 10% глицерол илова карда, дар ҳарорати 45℃ изолятсия карда шавад.Агар ба ПТР 1/10 мањсулоти ретротранскрипт-реаксия илова карда шавад, консентратсияи глицерол дар реаксияи амплификация 0,4% -ро ташкил медињад, ки ин барои боздоштани ПЗР кифоя нест.

5. Коркарди RNaseH:

Ҳассосиятро тавассути табобати реаксияҳои синтези cDNA бо RNaseH пеш аз PCR беҳтар кардан мумкин аст.Барои баъзе шаблонҳо, чунин мешуморанд, ки РНК дар реаксияи синтези cDNA пайвастшавии маҳсулоти пурқувватшударо пешгирӣ мекунад, дар ин ҳолат табобати RNaseH метавонад ҳассосиятро зиёд кунад.Умуман, табобати RNaseH барои тақвияти як қолаби ҳадафи нисбатан дарози пурраи cDNA, ба монанди скерози туберозӣⅡ бо нусхаи кам талаб карда мешавад.Барои ин қолаби душвор, RNaseH сигнали тавлидшудаи cDNA-и аз ҷониби SuperScriptⅡ ё AMV синтезшударо такмил дод.Барои аксари аксуламалҳои RT-PCR, табобати RNaseH ихтиёрӣ аст, зеро қадами денатуратсияи PCR дар 95℃ одатан РНК-ро аз РНК гидролиз мекунад: комплекси ДНК.

6. Усулҳои такмилёфта барои муайян кардани миқдори ками РНК:

RT-PCR махсусан ҳангоми мавҷуд будани миқдори ками РНК душвор аст.Илова кардани гликоген ҳамчун интиқолдиҳанда ҳангоми ҷудошавии РНК ба зиёд шудани ҳосили намунаҳои хурд мусоидат мекунад.Гликогени RNase-ро дар як вақт бо Trizol илова кардан мумкин аст.Гликоген дар об ҳалшаванда аст ва метавонад дар марҳилаи об бо РНК боқӣ монад, то дар боришоти минбаъда кӯмак кунад.Консентратсияи тавсияшудаи гликогени бидуни RNase 250 мкг/мл барои намунаҳои камтар аз 50 мг бофта ё 106 ҳуҷайраи парваришшуда мебошад.

Иловаи BSA-и ацетилонидашуда барои реаксияҳои баръакси транскрипсия бо истифода аз SuperScriptⅡ метавонад ҳассосиятро зиёд кунад ва барои миқдори ками РНК миқдори SuperScriptⅡ кам карда шавад ва илова кардани 40 воҳиди ингибитори нуклеаза RnaseOut сатҳи муайянкуниро беҳтар кунад.Агар гликоген дар ҷудокунии РНК истифода шавад, илова кардани ингибиторҳои BSA ё RNase барои баръакси реаксияҳои транскрипсия бо истифода аз SuperScriptⅡ тавсия дода мешавад.

Ⅱ. Баланд бардоштани хосияти RT-PCR

1. Синтези cNDA:

Се усули гуногунро барои оғози синтези риштаи якуми cDNA истифода бурдан мумкин аст ва хосияти нисбии ҳар як усул ба миқдор ва намуди cDNA-и синтезшуда таъсир мерасонад.

Усули ибтидоии тасодуфӣ аз се усул камтар мушаххас аст.Примерҳо дар сайтҳои гуногун дар тӯли транскрипт коркард карда мешаванд, то cDNA-и кӯтоҳ ва қисман дарозиро тавлид кунанд.Ин усул аксар вақт барои ба даст овардани пайдарпаии терминалҳои 5' ва cDNA аз қолабҳои РНК бо минтақаҳои сохтории дуюмдараҷа ё сайтҳои қатъшаванда, ки транскриптазаҳои баръакс такрор карда наметавонанд, истифода мешавад.Барои ба даст овардани дарозтарин cDNA, таносуби праймерҳо ба РНК дар ҳар як намунаи РНК бояд ба таври эмпирикӣ муайян карда шавад.Консентратсияи ибтидоии праймерҳои тасодуфӣ аз 50 то 250нг дар як системаи реаксияи 20μl аст.Азбаски cDNA аз РНК-и умумӣ бо истифода аз праймерҳои тасодуфӣ синтез карда мешавад, асосан РНК-и рибосомӣ мебошад, одатан поли(А)+РНК ҳамчун қолаб интихоб карда мешавад.

Оғози Oligo(dT) нисбат ба праймерҳои тасодуфӣ мушаххастар аст.Он бо думи поли(А), ки дар охири 3′-и mRNA дар аксари ҳуҷайраҳои эукариотӣ мавҷуд аст, гибридизатсия мешавад.Азбаски поли(А)+РНК тақрибан аз 1% то 2% РНК-и умумиро ташкил медиҳад, миқдор ва мураккабии cDNA нисбат ба истифодаи праймерҳои тасодуфӣ хеле камтар аст.Аз сабаби хусусияти баланди худ, олиго (dT) одатан оптимизатсияи РНК ба таносуби праймер ва интихоби поли(А)+ талаб намекунад.Тавсия дода мешавад, ки барои як системаи реаксияи 20 мкл 0,5 мкг олиго (дТ) истифода шавад.oligo(dT)12-18 барои аксари RT-PCR мувофиқ аст.Системаи ThermoScript RT-PCR аз сабаби устувории хуби гармиаш oligo(dT)20-ро таъмин мекунад ва барои ҳарорати баландтари нигоҳдорӣ мувофиқ аст.

Примерҳои мушаххаси ген (GSP) беҳтарин праймерҳои мушаххас барои қадами транскрипсияи баръакс мебошанд.GSP як олигонуклеозиди антисенсе мебошад, ки метавонад махсусан бо пайдарпаии таъиноти РНК гибридизатсия карда шавад, на ҳама Рнаҳоро ба монанди праймерҳои тасодуфӣ ё олиго (dT).Қоидаҳое, ки барои тарҳрезии праймерҳои PCR истифода мешаванд, инчунин ба тарҳрезии реаксияи транскрипсияи баръакси GSP дахл доранд.GSP метавонад ҳамон пайдарпаӣ бошад, ки праймери пурқувваткунанда дар охири mRNA3' тоза карда мешавад ё GSP метавонад барои коркарди поёноб бо праймери пурқувваткунандаи баръакс тарҳрезӣ шавад.Барои баъзе объектҳои пурқувватшуда барои бомуваффақияти RT-PCR зиёда аз як праймери антисенс тарҳрезӣ кардан лозим аст, зеро сохтори дуюмдараҷаи РНК-и мақсаднок метавонад пайвастшавии праймерро пешгирӣ кунад.Тавсия дода мешавад, ки 1pmol antisense GSP дар системаи реаксияи синтези занҷираи 20 мкл истифода шавад.

2. Баланд бардоштани ҳарорати нигоҳдории гармии транскрипсияи баръакс:

Барои пурра истифода бурдани хосиятҳои GSP, бояд транскриптазаи баръакс бо устувории гармии баланд истифода шавад.Транскриптазаи баръакси ба гармӣ устуворро дар ҳарорати баландтар изолятсия кардан мумкин аст, то шиддатнокии реаксияро зиёд кунад.Масалан, агар GSP дар 55°С гарм карда шавад, он гоҳ хусусияти GSP пурра истифода намешавад, агар транскрипсияи баръакс дар 37°C бо шиддати паст бо истифода аз AMV ё M-MLV анҷом дода шавад.Аммо, SuperScripⅡ ва ThermoScript метавонанд дар ҳарорати 50℃ ё баландтар реаксия кунанд, ки ин маҳсулоти ғайримуқаррариро, ки дар ҳарорати паст истеҳсол мешаванд, нест мекунад.Барои хосияти максималӣ, омехтаи РНК/праймерро метавон мустақиман аз ҳарорати денатуратсияи 65℃ ба ҳарорати нигоҳдории транскрипсияи баръакс бо иловаи омехтаи қаблан гармшудаи 2 x реаксия (оғози гармии синтези cDNA) интиқол дод.Ин барои пешгирии ҷуфтшавии пойҳо байни молекулаҳо дар ҳарорати паст кӯмак мекунад.Истифодаи асбоби ПТР гузариши зиёди ҳароратро барои RT-PCR содда мекунад.

3. Кам кардани ифлосшавии геномии ДНК:

Як мушкилии эҳтимолӣ бо RT-PCR ин аст, ки РНК ДНК-и геномиро олуда мекунад.Истифодаи усулҳои беҳтари ҷудокунии РНК, ба монанди Trizol Reagent, олудашавии геномии ДНК-ро дар омодагии РНК коҳиш медиҳад.Барои пешгирӣ кардани маҳсулоте, ки аз ДНК-и геномӣ тавлид мешавад, РНК-ро метавон бо дараҷаи амплификацияи DnasⅠ коркард кард, то ДНК-и олудашударо пеш аз транскрипсияи баръакс хориҷ кунад.Намунаҳо дар 65 ℃ дар 2,0 мм EDTA барои 10 дақиқа нигоҳ дошта шуданд, то ҳазми DNaseⅠ қатъ карда шаванд.EDTA ионҳои магнийро хелат мекунад, то гидролизи РНК вобаста ба магнийро, ки дар ҳарорати баланд рух медиҳад, пешгирӣ мекунад.

Барои ҷудо кардани cDNA-и амплификацияшуда аз маҳсулоти амплификацияи ДНК геном, праймерҳоеро, ки бо экзони ҷудошуда ҷудо карда мешаванд, тарҳрезӣ кардан мумкин аст.Маҳсулоти ПТР, ки аз cDNA гирифта шудаанд, назар ба маҳсулоти аз ДНК-и геномии олудашуда кӯтоҳтар хоҳад буд.Таҷрибаи назоратшаванда бидуни транскрипсияи баръакс низ дар ҳар як қолаби РНК гузаронида мешавад, то муайян кунад, ки порчаи додашуда аз ДНК геномӣ ё cDNA аст.Маҳсулоти PCR, ки дар сурати набудани транскрипсияи баръакс ба даст оварда шудаанд, аз геном гирифта мешаванд.

Маҳсулоти марбут

RT-PCR осон^ᵀᴹМан (як қадам)

-Маҷмӯаи якқадам имкон медиҳад, ки транскрипсияи баръакс ва PCR дар як қубур гузаронида шаванд.Он танҳо лозим аст, ки RNA шаблон, праймерҳои мушаххаси PCR ва RNase-Free ddH илова кунад₂O.

-Таҳлили миқдории РНК-ро дар вақти воқеӣ зуд ва дақиқ анҷом додан мумкин аст.

-Маҷмӯа реагенти беҳамтои транскрипсияи баръакси Foregene ва DNA Polymerase Foregene HotStar Taq-ро дар якҷоягӣ бо системаи беназири реаксия истифода мебарад, то самаранокии тақвият ва хосияти реаксияро самаранок беҳтар кунад.

-Системаи реаксияи оптимизатсияшуда вокунишро ба ҳассосияти баландтари ошкоркунӣ, устувории гармидиҳӣ ва таҳаммулпазирии беҳтар медиҳад.

RT Easy II (Бо GDNase) Master Premix барои синтези аввалини CDNA барои PCR дар вақти воқеӣ бо GDNase

-Қобилияти самараноки хориҷ кардани gDNA, ки метавонад gDNA-ро дар қолаб дар давоми 2 дақиқа хориҷ кунад.

-Системаи самараноки транскрипсияи баръакс, барои анҷом додани синтези риштаи якуми cDNA ҳамагӣ 15 дақиқа вақт лозим аст.

-Шаблонҳои мураккаб: қолабҳои дорои мундариҷаи баланди GC ва сохтори мураккаби дуюмдараҷа низ метавонанд бо самаранокии баланд баргардонида шаванд.

-Системаи транскрипсияи баръакси ҳассосияти баланд, қолибҳои сатҳи pg инчунин метавонанд cDNA-и баландсифат гиранд.

-Системаи транскрипсияи баръакс устувории баланди гармӣ дорад, ҳарорати оптималии реаксия 42 ℃ аст ва он то ҳол дар 50 ℃ иҷрои хуби транскрипсияи баръакс дорад.