1. Дониши асосӣ (агар шумо хоҳед, ки қисми таҷрибавиро бинед, лутфан бевосита ба қисми дуюм гузаред)
Ҳамчун реаксияи ҳосилшудаи ПТР анъанавӣ, PCR дар вақти воқеӣ асосан тағирёбии миқдори маҳсулоти пурқувватро дар ҳар як давраи реаксияи пурқувваткунии PCR дар вақти воқеӣ тавассути тағир додани сигнали флуоресцентӣ назорат мекунад ва қолаби ибтидоиро тавассути муносибати байни арзиши ct ва каҷи стандартӣ ба таври миқдорӣ таҳлил мекунад.
Маълумоти мушаххаси RT-PCR инҳояндасоси, ҳадди флуоресцентваАрзиши Ct.
| ибтидоӣ: | Қимати флуорессенси давраҳои 3-15-ум дараҷаи ибтидоӣ (базавӣ) мебошад, ки дар натиҷаи хатогиҳои баъзан ченкунӣ ба вуҷуд меояд. |
| Ҳадди (ҳадди): | Ба маҳдудияти муайянкунии флуорессенсия, ки дар мавқеъи мувофиқ дар минтақаи афзоиши экспоненсиалии хатти пурқувват муқаррар шудааст, дар маҷмӯъ 10 маротиба аз инҳирофи стандартии хатти асосӣ ишора мекунад. |
| Арзиши CT: | Ин шумораи давраҳои PCR аст, вақте ки арзиши флуоресцент дар ҳар як найчаи реаксия ба ҳадди ниҳоӣ мерасад. Қимати Ct ба маблағи қолаби ибтидоӣ мутаносиби баръакс аст. |
Усулҳои маъмули тамғагузорӣ барои RT-PCR:
| усул | бартарй | камбудй | доираи татбиқ |
| SYBR GreenⅠ | Истифодаи васеъ, ҳассос, арзон ва қулай | Талаботи праймер баланд буда, ба бандҳои ғайримуқаррарӣ моил аст | Он барои таҳлили миқдории генҳои гуногуни мақсаднок, тадқиқот оид ба ифодаи генҳо ва тадқиқот оид ба ҳайвонот ва растаниҳои трансгении рекомбинант мувофиқ аст. |
| TaqMan | Хусусияти хуб ва такроршавандагии баланд | Нарх баланд аст ва танҳо барои ҳадафҳои мушаххас мувофиқ аст. | Муайян кардани патогенҳо, таҳқиқоти генҳои муқовимат ба маводи мухаддир, арзёбии самаранокии маводи мухаддир, ташхиси бемориҳои генетикӣ. |
| чароғи молекулавӣ | Хусусияти баланд, флуоресцентсия, заминаи паст | Нархаш баланд аст, он танҳо барои таъини мушаххас мувофиқ аст, тарҳаш душвор аст ва нархаш баланд аст. | Таҳлили мушаххаси ген, таҳлили SNP |
2. Қадамҳои таҷрибавӣ
2.1 Дар бораи гурӯҳбандии таҷрибавӣ- дар гурўњ бояд чанд чоњ бошад ва такрори биологї бошад.
| ① | Назорати холӣ | Барои муайян кардани ҳолати афзоиши ҳуҷайраҳо дар таҷрибаҳо истифода мешавад |
| ② | Назорати манфии siRNA (пайванди ғайри мушаххаси siRNA) | Хусусияти амали RNAi-ро нишон диҳед.siRNA метавонад вокуниши стрессро дар консентратсияи 200 нМ ба вуҷуд орад. |
| ③ | Назорати реагенти трансфексия | Заҳролуд будани реагенти трансфексия ба ҳуҷайраҳо ё таъсир ба ифодаи гени мақсаднокро истисно кунед |
| ④ | siRNA бар зидди гени мақсаднок | Ифодаи гени мақсаднокро вайрон кунед |
| ⑤ (ихтиёрӣ) | siRNA мусбат | Барои бартараф кардани мушкилоти системаи таҷрибавӣ ва мушкилоти амалиётӣ истифода мешавад |
| ⑥ (ихтиёрӣ) | siRNA назорати флуоресцентӣ | Самаранокии интиқоли ҳуҷайраҳоро бо микроскоп мушоҳида кардан мумкин аст |
2.2 Принсипҳои тарҳрезии ибтидоӣ
| Андозаи васеъшудаи фрагмент | Беҳтараш дар 100-150б |
| Дарозии Primer | 18-25б |
| Мазмуни GC | 30%-70%, беҳтараш 45%-55% |
| Арзиши Tm | 58-60 ℃ |
| пайдарпай | Пешгирӣ кардани T/C пайваста;A/G пайваста |
| 3 пайдарпайии ниҳоӣ | Аз GC rich ё AT rich худдорӣ кунед;пойгоҳи терминал беҳтараш G ё C аст;беҳтар аст, ки аз Т |
| Мукаммалият | Аз пайдарпайии иловагии зиёда аз 3 асос дар дохили праймер ё байни ду праймер худдорӣ кунед |
| Хусусият | Барои тасдиқи мушаххасоти ибтидоӣ ҷустуҷӯи таркишро истифода баред |
①SiRNA ба намудҳо хос аст ва пайдарпаии намудҳои гуногун гуногун хоҳад буд.
②SiRNA дар хокаи яхкардашуда бастабандӣ карда мешавад, ки онро дар ҳарорати хонагӣ барои 2-4 ҳафта устувор нигоҳ доштан мумкин аст.
2.3 Асбобҳо ё реактивҳое, ки бояд пешакӣ омода карда шаванд
| Primer (истифодаи дохилӣ) | Аз ҷумла ба пеш ва бозгашт ду |
| Примерҳо (гени мақсаднок) | Аз ҷумла ба пеш ва бозгашт ду |
| Target Si RNA (3 тасма) | Умуман, ширкат 3 тасмаро синтез мекунад ва сипас яке аз се тасмаро тавассути RT-PCR интихоб мекунад. |
| Маҷмӯаи интиқол | Lipo2000 ва ғайра. |
| Маҷмӯаи истихроҷи босуръати RNA | Барои истихроҷи РНК пас аз трансфекция |
| Маҷмӯи транскрипсияи босуръати баръакс | барои синтези cDNA |
| Маҷмӯаи тақвияти PCR | 2 × Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 Оид ба масъалаҳое, ки бояд дар марҳилаҳои мушаххаси таҷрибавӣ ба онҳо таваҷҷӯҳ зоҳир карда шаванд:
①Раванди интиқоли siRNA
1. Барои пластинка, шумо метавонед лавҳаи 24-чоҳ, плитаи 12-чоҳ ё лавҳаи 6-чоҳро интихоб кунед (консентратсияи миёнаи РНК дар ҳар як чоҳи плитаи 24-чоҳи пешниҳодшуда тақрибан 100-300 нг/уЛ аст) ва зичии оптималии трансфексияи ҳуҷайраҳо то 60%-80% ё ҳамин тавр аст.
2. Қадамҳои интиқол ва талаботи мушаххас ба таври қатъӣ мувофиқи дастурҳо мебошанд.
3. Пас аз интиқол, намунаҳоро дар давоми 24-72 соат барои муайян кардани mRNA (RT-PCR) ё муайян кардани сафеда дар давоми 48-96 соат (ВБ) ҷамъоварӣ кардан мумкин аст.
② Раванди истихроҷи РНК
1. Пешгирии олудашавӣ бо ферментҳои экзогенӣ.Он асосан пӯшидани ниқобҳо ва дастпӯшҳоро дар бар мегирад;бо истифода аз маслиҳатҳои пипеткаҳои стерилизатсияшуда ва қубурҳои EP;обе, ки дар тачриба истифода бурда мешавад, бояд RNase-Free бошад.
2. Тавсия дода мешавад, ки ду маротиба тавре, ки дар маҷмӯаи истихроҷи зуд пешниҳод шудааст, иҷро кунед, ки дар ҳақиқат покӣ ва ҳосилро беҳтар мекунад.
3. Моеъи партов набояд ба сутуни РНК нарасад.
③ Миқдори РНК
Пас аз истихроҷи РНК, онро мустақиман бо Nanodrop муайян кардан мумкин аст ва ҳадди ақали хониш метавонад то 10нг/ул паст бошад.
④Раванди транскрипсияи баръакс
1. Аз сабаби ҳассосияти баланди RT-qPCR, бояд барои ҳар як намуна ҳадди аққал 3 чоҳҳои мувозӣ сохта шаванд, то аз ҳад зиёд фарқ кардани Ct-и минбаъда ё SD барои таҳлили оморӣ хеле калон бошад.
2. Мастер миксро такроран ях накунед ва об накунед.
3. Ҳар як қубур/сӯрох бояд бо нӯги нав иваз карда шавад!Барои илова кардани намунаҳо як нӯги пипеткаро пайваста истифода набаред!
4. Плёнкае, ки ба пластинкаи 96-чохи часпонида шудааст, пас аз илова кардани намуна бояд бо табак хамвор карда шавад.Пеш аз гузоштан ба дастгох центрифуга кардан бехтар аст, то моеъ дар девори найча ба поён равон шуда, футури хаворо тоза кунад.
⑤Таҳлили каҷҳои умумӣ
| Давраи афзоиши логарифмӣ вуҷуд надорад | Эҳтимол консентратсияи баланди шаблон |
| Арзиши CT нест | Қадамҳои нодуруст барои муайян кардани сигналҳои флуоресцентӣ; таназзули праймерҳо ё зондҳо - якпорчагии онро тавассути электрофорези PAGE муайян кардан мумкин аст; миқдори нокифояи қолаб; таназзули қолибҳо – пешгирӣ аз воридшавии ифлосиҳо ва яхкунӣ ва обшавии такрорӣ ҳангоми тайёр кардани намуна; |
| Ct>38 | Самаранокии пасти тақвият;Маҳсулоти PCR хеле дароз аст;ҷузъҳои гуногуни реаксия вайрон мешаванд |
| Каҷи пурқуввати хатӣ | Зондҳо метавонанд бо давраҳои такрории яхбандӣ ё таъсири тӯлонии рӯшноӣ қисман хароб шаванд. |
| Тафовут дар сӯрохиҳои такрорӣ махсусан калон аст | Маҳлули реаксия пурра гудохта нашудааст ё маҳлули реаксия омехта нашудааст;ваннаи гармии асбоби PCR бо моддаҳои флуоресцентӣ олуда шудааст |
2.5 Дар бораи таҳлили маълумот
Таҳлили маълумоти qPCR метавонад ба миқдорбандии нисбӣ ва миқдори мутлақ тақсим карда шавад.Масалан, ҳуҷайраҳои гурӯҳи табобат дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои гурӯҳи назоратӣ,
mRNA-и гени X чанд маротиба тағир меёбад, ин миқдорияти нисбӣ аст;дар шумораи муайяни ҳуҷайраҳо mRNA-и гени X
Чанд нусха вуҷуд дорад, ин миқдори мутлақ аст.Одатан он чизе, ки мо дар лаборатория бештар истифода мебарем, усули нисбии миқдорӣ мебошад.Одатан,усули 2-ΔΔctбештар дар таҷрибаҳо истифода мешавад, бинобар ин танҳо ин усул дар ин ҷо ба таври муфассал муаррифӣ карда мешавад.
Усули 2-ΔΔct: Натиҷаи бадастомада фарқияти ифодаи гени мақсаднок дар гурӯҳи таҷрибавӣ нисбат ба гени мақсаднок дар гурӯҳи назоратӣ мебошад.Зарур аст, ки самаранокии амплификацияи ҳам гени мақсаднок ва ҳам гени истинодҳои дохилӣ ба 100% наздик бошад ва инҳирофи нисбӣ набояд аз 5% зиёд бошад.
Усули ҳисоб чунин аст:
Гурӯҳи назорати Δct = арзиши ct гени мақсаднок дар гурӯҳи назорат - ct арзиши гени истинод дар дохили гурӯҳи назорат
Гурӯҳи таҷрибавии Δct = арзиши ct гени мақсаднок дар гурӯҳи таҷрибавӣ - арзиши ct гени истинод дар гурӯҳи таҷрибавӣ
ΔΔct = Δct гурӯҳи таҷрибавӣ-Гурӯҳи назорати Δct
Дар ниҳоят, миқдори фарқияти сатҳи ифодаро ҳисоб кунед:
Тағир Fold = 2-ΔΔct (мувофиқ ба функсияи Excel POWER аст)
Маҳсулоти марбут:
Вақти фиристодан: 20 май-2023
