Асоси тарроҳии ибтидоӣ (99% мушкилотро ҳал кардан мумкин аст)
1. Дарозии ибтидоӣ: Китоби дарсӣ 15-30bp, одатан тақрибан 20bp талаб мекунад.Ҳолати воқеии беҳтар аст, ки 18-24bp бошад, то мушаххасотро таъмин кунад, аммо ҳамон қадар беҳтар аст, праймери хеле дароз низ хосиятро коҳиш медиҳад ва ҳосилро коҳиш медиҳад.
2. Давомнокии пурқуввати Primer: 200-500bp мувофиқ аст ва порчаро дар шароити мушаххас то 10кб васеъ кардан мумкин аст.
3. Пойгоҳи праймер: Мазмуни G+C бояд 40-60% бошад, таъсири хеле ками G+C амплификатсия хуб нест, G+C аз ҳад зиёд ба осонӣ пайдо шудани бандҳои ғайримахсус аст.ATGC беҳтарин ба таври тасодуфӣ тақсим карда мешавад, ки аз кластерҳои зиёда аз 5 нуклеотидҳои пурин ё пиримидин пешгирӣ карда мешавад.Мулти-gc барои охири 5′ ва пайдарпаии мобайнӣ барои баланд бардоштани устуворӣ, канорагирӣ аз GC-и бой дар охири 3′, ҳеҷ GC барои 3 пойгоҳи охир ё ҳеҷ GC барои 3 пойгоҳи охирини 5.
4. Аз сохтори дуюмдараҷа дар праймерҳо канорагирӣ кунед ва аз комплементация байни ду праймер, махсусан комплемент дар охири 3 канорагирӣ кунед, дар акси ҳол димери праймер ба вуҷуд меояд ва бандҳои ғайримуқаррарии пурқувватшуда тавлид мешаванд.
5. Пойгоҳҳо дар 3 'охири праймерҳо, бахусус пойгоҳҳои охирин ва пеш аз охирин, бояд ба таври қатъӣ ҷуфт карда шаванд, то аз нокомии PCR аз сабаби пойгоҳҳои терминалии ҷудонашаванда пешгирӣ карда шаванд.
6. Праймерҳо бо маконҳои мувофиқи ҷудошавӣ доранд ё метавонанд илова карда шаванд ва пайдарпаии ҳадафи пурқувватшуда бояд беҳтараш макони ҷудошавии мувофиқ дошта бошад, ки барои таҳлили ҷудошавӣ ё клонкунии молекулавӣ хеле муфид аст.
7. Хусусияти праймерҳо: праймерҳо набояд гомологияи возеҳ бо пайдарпаии дигар дар базаи пайдарпайии кислотаи нуклеинӣ дошта бошанд.
8. Истифодаи нармафзорро омӯзед: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Ин тарҳи онлайн беҳтарин кор мекунад).
Мазмуни дар боло овардашуда метавонад ҳадди аққал 99% мушкилоти тарроҳии ибтидоиро ҳал кунад.
Тафсилоти тарроҳии праймерро назорат кунед
1. Дарозии ибтидоӣ
Дарозии умумии ибтидоӣ 18 ~ 30 асос аст.Умуман, омили муҳимтарини муайян кардани ҳарорати гармшавии праймер дарозии праймер мебошад.Ҳарорати гармкунии праймер одатан интихоб карда мешавад (қимати Tm -5℃) ва баъзеҳо мустақиман арзиши Tm-ро истифода мебаранд.Формулаҳои зеринро барои тахминан ҳисоб кардани ҳарорати гармшавии праймерҳо истифода бурдан мумкин аст.
Вақте ки дарозии праймер камтар аз 20 бит аст: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Ҳангоме ки дарозии праймер аз 20bp зиёд аст: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/length-5℃
Илова бар ин, бисёр нармафзорҳоро барои ҳисоб кардани ҳарорати гармкунӣ низ истифода бурдан мумкин аст, принсипи ҳисобкунӣ гуногун хоҳад буд, бинобар ин баъзан арзиши ҳисобшуда метавонад холигии хурд дошта бошад.Барои оптимизатсияи реаксияҳои PCR, праймерҳои кӯтоҳтарин, ки ҳарорати гармшавии на камтар аз 54 ℃ барои самаранокӣ ва хосияти беҳтарин истифода мешаванд.
Дар маҷмӯъ, хосияти ибтидоӣ барои ҳар як нуклеотиди иловагӣ чор маротиба зиёд мешавад, ба тавре ки дарозии ҳадди ақали ибтидоӣ барои аксари барномаҳо 18 нуклеотид аст.Маҳдудияти болоии дарозии ибтидоӣ чандон муҳим нест, асосан ба самаранокии реаксия вобаста аст.Аз сабаби энтропия, праймер ҳар қадар дарозтар бошад, ҳамон қадар суръати он барои пайвастшавӣ ба ДНК-и мақсаднок пасттар мешавад, то як қолаби устувори дуқабата барои пайвастшавии ДНК полимеразро ташкил кунад.
Ҳангоми истифодаи нармафзор барои тарҳрезии праймерҳо, дарозии праймерҳоро дар навбати худ аз рӯи арзиши TM муайян кардан мумкин аст, махсусан барои праймерҳои флуоресцентии PCR миқдорӣ, TM = 60 ℃ ё он қадар бояд назорат карда шавад.
2.Мӯҳтавои GC
Умуман, мундариҷаи G+C дар пайдарпаии ибтидоӣ 40% ~ 60% аст ва мундариҷаи GC ва Tm арзиши як ҷуфт праймерҳо бояд ҳамоҳанг карда шаванд.Агар праймер тамоюли ҷиддии GC ё AT дошта бошад, ба 5' охири праймер миқдори мувофиқи думи A, T ё G ва C илова карда мешавад.
3. Ҳарорати таҳаммулпазирӣ
Ҳарорати тозакунӣ бояд аз ҳарорати аз занҷир 5 дараҷа пасттар бошад.Агар шумораи пойгоҳҳои ибтидоӣ кам бошад, ҳарорати гармкуниро ба таври мувофиқ зиёд кардан мумкин аст, ки метавонад хусусияти PCR-ро зиёд кунад.Агар шумораи пойгоҳҳо зиёд бошад, ҳарорати гармкуниро ба таври мувофиқ коҳиш додан мумкин аст.Тафовути ҳарорати гармкунӣ байни як ҷуфт праймерҳои 4℃ ~ 6℃ ба ҳосили PCR таъсир намерасонад, аммо идеалӣ ҳарорати гармкунии як ҷуфт праймерҳо яксон аст, ки метавонад дар байни 55 ℃ ~ 75 ℃ фарқ кунад.
4. Аз майдони сохтори дуюмдараҷаи қолаби пурқувват канорагирӣ кунед
Ҳангоми интихоби порчаи пурқувватшуда беҳтар аст, ки аз минтақаи сохтори дуюмдараҷаи қолаб канорагирӣ кунед.Сохтори устувори дуюмдараҷаи порчаи мақсаднокро тавассути нармафзори дахлдори компютерӣ пешгӯӣ кардан ва ҳисоб кардан мумкин аст, ки барои интихоби қолаб муфид аст.Натиҷаҳои таҷрибавӣ нишон медиҳанд, ки васеъшавӣ аксар вақт бемуваффақият аст, вақте ки энергияи озоди минтақаи васеъшаванда (△G) камтар аз 58,6 кҶ/мол аст.
5. Мутобиқат бо ДНК-и мақсаднок
Вақте ки пайдарпаии ДНК-и мақсаднок калон аст, праймер метавонад ба қисмҳои зиёди ДНК-и мақсаднок пайваст шавад, ки дар натиҷа бандҳои сершумор пайдо мешаванд.Ин дафъа зарур аст, ки санҷиши нармафзори BLAST, вебсайтро истифода баред:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Ҳамоҳангкунии ду пайдарпайро (bl2seq) интихоб кунед.
Ҷойгир кардани пайдарпаии праймер ба минтақаи 1 ва пайдарпаии мақсадноки ДНК ба минтақаи 2 ивазшаванда аст ва BLAST имкониятҳои иловагӣ, антисенс ва дигарро ҳисоб мекунад, аз ин рӯ корбарон набояд пайхас кунанд, ки оё ҳарду занҷир занҷири ҳис мекунанд.Шумо инчунин метавонед рақами GI-ро ворид кунед, агар шумо рақами GI-и пайдарпайро дар пойгоҳи додаҳо донед, бинобар ин ба шумо лозим нест, ки як қисми зиёди пайдарпайро часбонед.Ниҳоят, Ҳамоҳангкунӣ дар 3 -ро клик кунед, то бубинед, ки праймер дар ДНК-и мақсаднок сайтҳои сершумори гомологӣ дорад.
6. Терминали ибтидоӣ
Дар охири 3 'праймер аз он ҷое, ки васеъкунӣ оғоз мешавад, аз ин рӯ муҳим аст, ки аз он ҷо сар шудани номувофиқӣ пешгирӣ карда шавад.Охири 3' набояд аз 3 пайдарпай G ё C зиёд бошад, зеро ин боиси иштибоҳан оғоз шудани праймер дар минтақаи пайдарпайии ғанисозии G+C мегардад.Нӯги 3' наметавонад ягон сохтори дуюмдараҷаро ташкил диҳад, ба истиснои реаксияҳои махсуси PCR (AS-PCR), охири 3'-и праймер номувофиқ нест.Масалан, агар минтақаи рамзгузорӣ пурзӯр карда шавад, 3' охири праймер набояд дар мавқеи сеюми кодон қатъ карда шавад, зеро мавқеи сеюми кодон ба таназзул майл дорад, ки ба хусусият ва самаранокии амплификация таъсир мерасонад.Ҳангоми истифода бурдани праймерҳои замима, ба ҷадвали истифодаи кодон муроҷиат кунед, ба афзалиятҳои биологӣ диққат диҳед, праймерҳои иловагиро дар охири 3' истифода набаред ва консентратсияи баландтари праймерҳоро (1uM-3uM) истифода баред.
7. Сохтори дуюмдараҷаи ибтидоӣ
Худи праймерҳо набояд пайдарпайии иловагиро дошта бошанд, вагарна худи праймерҳо ба сохторҳои мӯи мӯй печида мешаванд ва ин сохтори дуюмдараҷа ба бастани праймерҳо ва қолибҳо аз сабаби монеаи стерикӣ таъсир мерасонад.Агар доварии сунъӣ истифода шавад, пойгоҳҳои пайвастаи пурраи худи праймерҳо набояд аз 3bp зиёд бошанд.Дар байни ду праймер набояд ягон иловагии иловагӣ вуҷуд дошта бошад, махсусан аз такрори 3 'охири бояд пешгирӣ карда шавад, то ташаккули димерҳои ибтидоӣ пешгирӣ карда шавад.Умуман, дар байни як ҷуфти ибтидоӣ набояд бештар аз 4 асосҳои пайдарпай гомология ё пуррагӣ мавҷуд бошанд.
8. Нишондиҳандаҳо ё маконҳоро илова кунед
5 'охири ба хусусияти амплификатсия таъсири кам дорад ва аз ин рӯ метавонад бидуни таъсир ба хосияти пурқувватсозӣ тағир дода шавад.Тағироти ибтидоии 5 'охири инҳоро дар бар мегирад: илова кардани макони маҳдудкунандаи фермент;Биотин, флуорессенсия, дигоксин, Eu3+ ва ғайра. Ҷорисозии пайдарпаии ДНК-и сафеда;Ҷорӣ кардани сайтҳои мутатсия, ворид кардан ва гум кардани пайдарпаии мутатсия ва ҷорӣ кардани пайдарпаии промоторҳо ва ғайра. Пойгоҳҳои иловагӣ ба самаранокии амплификация таъсир мерасонанд ва имконияти ташаккули димери ибтидоиро зиёд мекунанд, аммо барои қадами оянда бояд баъзе гузаштҳо дода шаванд.пайдарпаии иловагӣ, ки дар пайдарпаии ҳадаф вуҷуд надорад, ба монанди сайтҳои маҳдуд ва пайдарпаии промоутер, мумкин аст ба 5' охири праймер илова карда шавад, бе таъсир мушаххас.Ин пайдарпайҳо ба ҳисобкунии арзишҳои ибтидоии Tm дохил карда намешаванд, аммо бояд барои пуррагӣ ва сохтори дуввумдараҷаи дохилӣ санҷида шаванд.
9. Зерклонҳо
Аксар вақт, PCR танҳо клонкунии пешакӣ аст ва он гоҳ ба мо лозим аст, ки порчаи мақсаднокро ба векторҳои гуногун зерклон кунем, аз ин рӯ мо бояд пойгоҳҳои иловагиро барои амалиёти оянда дар марҳилаи PCR тарҳрезӣ кунем.
Баъзе пайдарпайҳое, ки барои зерклонсозӣ пешбинӣ шудаанд, дар зер ҷамъбаст шудаанд.
Макони маҳдудкунии эндонуклеазҳои маҳдудкунанда илова карда шуд
Илова кардани маконҳои маҳдудкунандаи фермент усули маъмултарин барои зерклон кардани маҳсулоти PCR мебошад.Умуман, макони тақсимшавӣ шаш пойгоҳ аст, ба ғайр аз 5 'охири сайти ҷудошавӣ бояд 2 ~ 3 пойгоҳҳои муҳофизатӣ илова карда шавад.Аммо, шумораи асосҳои муҳофизатӣ, ки ферментҳои гуногун талаб мекунанд, гуногун аст.Масалан, SalⅠ заминаи муҳофизатиро талаб намекунад, EcoRⅤ 1 пойгоҳи муҳофизатиро талаб мекунад, NotⅠ 2 пойгоҳи муҳофизатӣ ва Ҳинд Ⅲ 3 пойгоҳи муҳофизатиро талаб мекунад.
LIC думро илова мекунад
Номи пурраи LIC клонкунии мустақили Ligation аст, усули клонкунӣ аз ҷониби Навоген махсус барои қисми вектори pET ихтироъ шудааст.Интиқолдиҳандаи pET, ки бо усули LIC таҳия шудааст, дорои 12-15 риштаи ягонаи қаҳваи ғайримукаммал мебошад, ки нӯгҳои часпаки мувофиқро дар порчаи воридкунии ҳадаф пурра мекунанд.Бо маќсадњои амплификация, пайдарпаии праймери 5′-и порчаи воридшуда бояд вектори LIC-ро пурра кунад.Фаъолияти экстранектии 3'→5' полимеразаи T4 DNA метавонад пас аз як муддати кӯтоҳ дар порчаи воридшуда як риштаи часпакро ташкил кунад.Азбаски маҳсулотро танҳо аз гармкунии мутақобилаи порчаи дохилшудаи омодашуда ва вектор ба вуҷуд овардан мумкин аст, ин усул хеле зуд ва самаранок аст ва он ба клонизатсия нигаронида шудааст.
Clone TA равона карда думи илова
Клонкунии TA қодир набуд, ки порчаро ба вектор равона кунад, бинобар ин баъдтар Invitrogen вектореро ҷорӣ кард, ки метавонад клонкуниро ҳадаф қарор диҳад, ки дар як канори он чаҳор пойгоҳи барҷастаи GTGGS мавҷуд буд.Аз ин рӯ, ҳангоми тарҳрезии праймерҳои ПТР, пайдарпаии иловагиҳо бояд мувофиқи он илова карда шаванд, то пораҳо "тамаркуз" шаванд.
Агар шумо вақти кам дошта бошед, шумо метавонед синтези мустақимро санҷед ва генро бо вектор муттаҳид созед, ки мо онро синтези генҳои ET дар музекулярҳо меномем.
D. Усули клонкунии In-Fusion
Лигаза лозим нест, реаксияи тӯлонӣ лозим нест.То он даме, ки пайдарпаӣ дар ҳарду канори вектори хаттӣ дар тарҳрезии праймерҳо ҷорӣ карда мешавад, пас маҳсулоти PCR ва вектори хаттӣ ба маҳлули ферменти дарунсохт, ки дорои BSA мавҷуд аст ва дар ҳарорати хонагӣ барои ним соат ҷойгир карда мешаванд, табдил додан мумкин аст.Ин усул махсусан барои табдили ҳаҷми калон мувофиқ аст.
10. Примерро якҷоя кунед
Баъзан, дар бораи тарҳрезии ибтидоӣ танҳо маълумоти маҳдуди пайдарпай маълум аст.Масалан, агар танҳо пайдарпаии аминокислотаҳо маълум бошад, праймери якҷояшавандаро тарҳрезӣ кардан мумкин аст.Примери муттаҳидшавӣ омехтаи пайдарпайии гуногун мебошад, ки тамоми имкониятҳои пойгоҳҳои мухталифро, ки як кислотаи аминокислотаро рамзгузорӣ мекунанд, ифода мекунанд.Барои баланд бардоштани хосият, шумо метавонед ба ҷадвали истифодаи кодон муроҷиат кунед, то замимаро мувофиқи афзалиятҳои асосии истифодаи организмҳои гуногун кам кунед.Гипоксантинро бо ҳама асосҳо ҷуфт кардан мумкин аст, то ҳарорати гармшавии праймерро паст кунад.Пойгоҳҳои замимашударо дар охири 3′-и праймер истифода набаред, зеро тоза кардани 3 пояи охирин дар охири 3′ барои оғоз кардани PCR дар ҷои нодуруст кифоя аст.Консентратсияи баландтари праймер (1μM то 3μM) истифода мешавад, зеро праймерҳо дар бисёр омехтаҳои замима ба қолаби мақсаднок хос нестанд.
Ашьёи хоми PCRназорат
1. Миқдори ибтидоӣ
Консентратсияи ҳар як праймер 0,1 ~ 1umol ё 10 ~ 100pmol аст.Беҳтар аст, ки бо миқдори камтарини праймер натиҷаи заруриро ба даст оред.Консентратсияи баланди праймер боиси номувофиқатӣ ва амплификацияи ғайримуқаррарӣ мегардад ва имкони ташаккули димерҳо дар байни праймерҳоро зиёд мекунад.
2. Консентратсияи ибтидоӣ
Консентратсияи праймерҳо ба хосият таъсир мерасонад.Консентратсияи оптималии ибтидоӣ одатан аз 0,1 то 0,5 мкм аст.Консентратсияи баландтари праймер ба пурқувват шудани маҳсулоти ғайримуқаррарӣ оварда мерасонад.
3. Ҳарорати гармкунии праймер
Дигар параметри муҳим барои праймерҳо ҳарорати обшавӣ (Тм) мебошад.Ин ҳароратест, ки 50% праймерҳо ва пайдарпаии комплементарӣ ҳамчун молекулаҳои дуқабати ДНК муаррифӣ мешаванд.Tm барои муқаррар кардани ҳарорати гармкунии PCR лозим аст.Идеалӣ, ҳарорати гармкунӣ ба қадри кофӣ паст аст, то обшавии самараноки праймерҳоро бо пайдарпаии мақсаднок таъмин кунад, аммо барои коҳиш додани ҳатмии ғайримуқаррарӣ кофӣ баланд аст.Ҳарорати оқилонаи гармкунӣ аз 55 ℃ то 70 ℃.Ҳарорати тозакунӣ одатан нисбат ба Tm праймер 5℃ пасттар муқаррар карда мешавад.
Якчанд формулаҳо барои гузоштани Tm мавҷуданд, ки вобаста ба формулаи истифодашуда ва пайдарҳамии ибтидоӣ хеле фарқ мекунанд.Азбаски аксари формулаҳо арзиши тахминии Tm-ро пешниҳод мекунанд, ҳама ҳарорати гармкунӣ танҳо нуқтаи ибтидоӣ мебошанд.Хусусиятро тавассути таҳлили якчанд реаксияҳо, ки ҳароратро тадриҷан баланд мекунанд, беҳтар кардан мумкин аст.Дар поён аз Tm-5℃ тахминӣ оғоз кунед ва тадриҷан ҳарорати гармкуниро бо афзоиши 2℃ зиёд кунед.Ҳарорати баландтари гармкунӣ ташаккули димерҳои ибтидоӣ ва маҳсулоти ғайримуқаррариро коҳиш медиҳад.Барои натиҷаҳои беҳтарин, ду праймер бояд арзишҳои тахминии Tm дошта бошанд.Агар фарқияти Tm-и ҷуфтҳои ибтидоӣ аз 5 ℃ зиёд бошад, праймерҳо бо истифода аз ҳарорати пасттар дар давра оғози бардурӯғ нишон медиҳанд.Агар ду праймер Tm гуногун бошанд, ҳарорати гармкуниро то 5℃ пасттар аз Tm пасттарин муқаррар кунед.Интихобан, барои баланд бардоштани хосият, панҷ давраро аввал дар ҳарорати гармкунӣ, ки барои Tm баландтар пешбинӣ шудаанд, ва баъдан давраҳои боқимондаро дар ҳарорати гармкунӣ, ки барои Tm камтар пешбинӣ шудаанд, иҷро кардан мумкин аст.Ин имкон медиҳад, ки нусхаи қисман қолаби таъинот дар шароити сахт ба даст оварда шавад.
4. Покӣ ва устувории Primer
Тозагии стандартии праймерҳои фармоишӣ барои аксари барномаҳои PCR мувофиқ аст.Хориҷ кардани гурӯҳҳои бензоил ва изобутилил тавассути намакзада хеле кам аст ва аз ин рӯ ба ПТР халал намерасонад.Баъзе барномаҳо барои нест кардани ҳама гуна пайдарпайии дарозии пурра дар раванди синтез поксозӣ талаб мекунанд.Ин пайдарпаии бурида ба амал меоянд, зеро самаранокии химияи синтези ДНК 100% нест.Ин як раванди даврашакл аст, ки реаксияҳои такрории кимиёвиро истифода мебарад, зеро ҳар як пойгоҳ барои сохтани ДНК аз 3' то 5' илова карда мешавад.Шумо метавонед дар ҳар ду давра ноком шавед.Примерҳои дарозтар, махсусан онҳое, ки аз 50 пойгоҳ зиёданд, миқдори зиёди пайдарпаии буридашуда доранд ва метавонанд тозакуниро талаб кунанд.
Ба ҳосили праймерҳо самаранокии химияи синтетикӣ ва усули тозакунӣ таъсир мерасонад.Ширкатҳои биофармасевтӣ, ба монанди Cytology ва Shengong, ҳама як воҳиди ҳадди ақали OD-ро барои таъмини ҳосили умумии олигонуклеозид истифода мебаранд.Примерҳои фармоишӣ дар шакли хокаи хушк фиристода мешаванд.Беҳтар аст, ки праймерҳоро дар TE дубора ҳал кунед, то консентратсияи ниҳоӣ 100μM бошад.TE аз оби деионизатсияшуда беҳтар аст, зеро рН об аксар вақт кислота аст ва боиси гидролизи олигонуклеозидҳо мегардад.
Устувории праймерҳо аз шароити нигоҳдорӣ вобаста аст.Хокаи хушк ва праймерҳои гудохташуда бояд дар -20 ℃ нигоҳ дошта шаванд.Праймерҳои дар TE дар консентратсияи зиёда аз 10μM гудохташуда метавонанд дар -20 ℃ барои 6 моҳ устувор нигоҳ дошта шаванд, аммо танҳо дар ҳарорати хонагӣ (15 ℃ то 30 ℃) барои камтар аз 1 ҳафта нигоҳ дошта мешаванд.Примерҳои хокаи хушкро дар -20С ҳадди ақал 1 сол ва дар ҳарорати хонагӣ (15С то 30С) то 2 моҳ нигоҳ доштан мумкин аст.
5. Ферментхо ва консентратсияи онхо
Дар айни замон, полимеразаи Taq DNA истифодашаванда асосан як ферментҳои гении муҳандисӣ мебошад, ки аз ҷониби бактерияҳои колиформ синтез карда мешавад.Миқдори ферменте, ки барои катализ кардани реаксияи маъмулии PCR лозим аст, тақрибан 2,5U аст (ба ҳаҷми умумии реаксияи 100ул ишора мекунад).Агар консентратсияи хеле баланд бошад, он метавонад ба амплификацияи ғайримуқаррарӣ оварда расонад;агар концентрация хеле паст бошад, микдори махсулоти синтетики кам мешавад.
6. Сифат ва консентратсияи dNTP
Сифати dNTP бо консентратсия ва самаранокии амплификацияи PCR зич алоқаманд аст.Хокаи dNTP донадор аст ва тағирёбии он дар сурати нодуруст нигоҳ доштани он фаъолияти биологии худро гум мекунад.Маҳлули dNTP туршӣ аст ва бояд дар консентратсияи баланд, бо маҳлули буферии 1M NaOH ё 1M Tris.HCL барои танзими PH он ба 7,0 ~ 7,5, миқдори ками зербастабандӣ, нигоҳдории яхкардашуда дар -20℃ истифода шавад.Якчанд бор обшавии яхкунӣ dNTP-ро вайрон мекунад.Дар реаксияи PCR, dNTP бояд 50 ~ 200umol / л бошад.Махсусан, бояд ба консентратсияи чор DNTPS бояд баробар бошад (тайёркунии молҳои баробар).Агар консентратсияи яке аз онҳо аз дигарон фарқ кунад (болотар ё пасттар), номутобиқатӣ ба вуҷуд меояд.Консентратсияи хеле паст ҳосили маҳсулоти PCR-ро коҳиш медиҳад.dNTP метавонад бо Mg2 + муттаҳид шавад ва консентратсияи Mg2 + -ро коҳиш диҳад.
7. Шаблон (гени мақсаднок) кислотаи нуклеинӣ
Миқдор ва дараҷаи тозакунии кислотаи нуклеинӣ яке аз пайвандҳои калидӣ барои муваффақият ё нокомии PCR мебошад.Усулҳои анъанавии тозакунии ДНК одатан SDS ва протеаза К-ро барои ҳазм ва партофтани намунаҳо истифода мебаранд.Вазифаҳои асосии СДС аз инҳо иборатанд: липидҳо ва сафедаҳо дар мембранаи ҳуҷайра, ки бо роҳи об кардани сафедаҳои мембрана мембранаи ҳуҷайраро нест мекунанд ва сафедаҳои ядроиро дар ҳуҷайра ҷудо мекунанд, СДС инчунин метавонад бо сафедаҳо пайваст шавад ва боришот;Протеаз К метавонад сафедаҳо, махсусан гистонҳои бо ДНК пайвастшударо гидролиз ва ҳазм кунад ва сипас барои истихроҷи сафедаҳо ва дигар ҷузъҳои ҳуҷайра фенол ва хлороформи органикиро истифода барад ва барои таҳшин кардани кислотаи нуклеин этанол ё спирти изопропилро истифода барад.Кислотаи нуклеини истихроҷшуда метавонад ҳамчун қолаб барои реаксияҳои PCR истифода шавад.Барои намунаҳои умумии ташхиси клиникӣ, як усули зуд ва соддаро барои пароканда кардани ҳуҷайраҳо, лизат кардани микроорганизмҳо, ҳазм кардан ва хориҷ кардани сафедаҳо аз хромосомаҳо ба генҳои ҳадафи озод истифода бурдан мумкин аст ва мустақиман барои амплификацияи PCR истифода мешавад.Истихроҷи қолаби РНК одатан усули гуанидин изотиоцианати ё протеаза К-ро барои пешгирӣ кардани RNase аз таназзули РНК истифода мебарад.
Консентратсияи 8.Mg2+
Mg2+ ба хосият ва ҳосилнокии амплификацияи ПЗР таъсири назаррас дорад.Дар реаксияи умумии PCR, вақте ки консентратсияи гуногуни dNTP 200umol/L аст, консентратсияи мувофиқи Mg2+ 1,5 ~ 2,0 ммоль/л аст.Консентратсияи Mg2+ хеле баланд аст, хосияти реаксия кам мешавад, амплификатсияи ғайримуқаррарӣ ба амал меояд, консентратсияи хеле паст фаъолияти полимеразаи Так ДНК-ро коҳиш медиҳад, ки дар натиҷа маҳсулоти реаксия кам мешавад.
Ионҳои магний ба якчанд ҷанбаҳои ПТР таъсир мерасонанд, аз қабили фаъолияти полимеразаи ДНК, ки ба ҳосил таъсир мерасонад;Намунаи дигар ин коркарди ибтидоӣ мебошад, ки ба хосият таъсир мерасонад.dNTP ва қолаб ба иони магний пайваст шуда, миқдори иони озоди магнийро барои фаъолияти фермент кам мекунанд.Консентратсияи оптималии ионҳои магний барои ҷуфтҳо ва қолибҳои гуногуни праймер фарқ мекунад, аммо консентратсияи маъмулии ибтидоии PCR бо 200μM dNTP 1,5 мм аст (эзоҳ: Барои PCR-и миқдорӣ дар вақти воқеӣ, маҳлули ионҳои магний аз 3 то 5 мм бо зондҳои флуоресцентиро истифода баред).Консентратсияи баландтари ионҳои озоди магний ҳосилро зиёд мекунад, аммо амплификацияи ғайримуқаррариро зиёд мекунад ва садоқатро коҳиш медиҳад.Барои муайян кардани консентратсияи оптималӣ, титратсияҳои ионҳои магний бо афзоиши 0,5 мм аз 1 мм то 3 мм анҷом дода шуданд.Барои кам кардани вобастагӣ аз оптимизатсияи ионҳои магний, полимеразаи Platinum Taq DNA метавонад истифода шавад.Полимеразаи Platinum Taq DNA қодир аст, ки функсияро дар доираи васеътари консентратсияи ионҳои магний нисбат ба полимеразаи Taq DNA нигоҳ дорад ва аз ин рӯ оптимизатсияи камтарро талаб мекунад.
9. Иловаҳои ривоҷдиҳандаи Pcr
Оптимизатсияи ҳарорати гармкунӣ, тарҳрезии праймер ва консентратсияи ионҳои магний барои тақвияти хоси аксари қолибҳо кифоя аст;аммо, баъзе қолибҳо, аз ҷумла онҳое, ки дорои мундариҷаи баланди GC мебошанд, чораҳои иловагиро талаб мекунанд.Иловаҳое, ки ба ҳарорати обшавии ДНК таъсир мерасонанд, роҳи дигари беҳтар кардани хосият ва ҳосили маҳсулотро фароҳам меоранд.Барои натиҷаҳои беҳтарин денатуратсияи пурраи қолаб лозим аст.
Илова бар ин, сохтори дуюмдараҷа пайвастшавии праймер ва васеъшавии ферментҳоро пешгирӣ мекунад.
Иловаҳои PCR, аз ҷумла формамид, DMSO, глицерин, бетаин ва PCRx Enhancer Solution, амплификацияро беҳтар мекунанд.Механизми имконпазири онҳо ин паст кардани ҳарорати обшавӣ мебошад, ки ба ин васила ба тоза кардани праймерҳо ва мусоидат ба паҳншавии полимеразаи ДНК тавассути минтақаи сохтори дуюмдараҷа мусоидат мекунад.PCRx Solution афзалиятҳои дигар дорад.Ҳангоми истифода бо полимеразаи Platinum Taq DNA ва Platinum Pfx DNA polymerase оптимизатсияи ҳадди ақали ионҳои магний талаб карда мешавад.Ҳамин тариқ, техникаи Platinum бо иловаи иловагӣ барои баланд бардоштани хосият ҳангоми коҳиш додани вобастагии равиши сеюм, оптимизатсияи ионҳои магний.Барои натиҷаҳои беҳтарин, консентратсияи иловаҳо бояд оптимизатсия карда шавад, махсусан DMSO, формамид ва глицерол, ки полимеразаи Taq DNA-ро бозмедоранд.
10. Оғози гарм
ПТР-и гарм ба ғайр аз тарҳи хуби праймер, яке аз усулҳои муҳимтарини беҳтар кардани мушаххасоти PCR мебошад.Гарчанде ки ҳарорати оптималии дарозшавии полимеразаи Taq DNA 72 ℃ аст, полимераз дар ҳарорати хонагӣ фаъол боқӣ мемонад.Ҳамин тариқ, маҳсулоти ғайримуқаррарӣ вақте истеҳсол карда мешаванд, ки ҳарорати нигоҳдорӣ аз ҳарорати гармкунӣ ҳангоми тайёр кардани реаксияи PCR ва дар оғози давраи гармӣ пасттар бошад.Пас аз ташаккул, ин маҳсулоти ғайримуқаррарӣ самаранок тақвият дода мешаванд.PCR-и гарм махсусан вақте самаранок аст, ки маконҳое, ки барои тарҳрезии праймер истифода мешаванд, бо ҷойгиршавии унсурҳои генетикӣ, аз қабили мутатсияҳои ба макон равонашуда, клонкунии экспрессия ё сохтмон ва коркарди унсурҳои генетикӣ, ки барои муҳандисии ДНК истифода мешаванд, маҳдуд аст.
Усули маъмули маҳдуд кардани фаъолияти полимеразаи Так ДНК ин омода кардани маҳлули реаксияи ПТР дар ях ва ҷойгир кардани он дар дастгоҳи пеш аз гармии ПТР мебошад.Ин усул содда ва арзон аст, аммо он фаъолияти ферментро ба итмом намерасонад ва аз ин рӯ, пурқувватшавии маҳсулоти ғайримуқаррариро пурра нест намекунад.
Принсипи гармӣ синтези ДНК-ро тавассути ҷилавгирӣ аз як ҷузъи муҳим то он даме, ки дастгоҳи ПТР ба ҳарорати денатуратсия мерасад, ба таъхир меандозад.Аксари усулҳои оғози гармии дастӣ, аз ҷумла иловаи таъхири полимеразаи Taq DNA, душвор аст, махсусан барои барномаҳои баландсуръат.Дигар усулҳои гармидиҳии гармӣ сипари мумиро барои иҳота кардани ҷузъи муҳим, аз ҷумла ионҳо ё ферментҳои магний ё ҷудо кардани ҷузъҳои реактивӣ, ба монанди қолабҳо ва буферҳо истифода мебаранд.Дар давраи гардиши гармӣ, ҷузъҳои гуногун ҳангоми обшавии мум ба ҳам омехта мешаванд.Мисли усули дастӣ оғоз кардани гарм, усули сипари муми душвор аст ва ба ифлосшавӣ майл дорад ва барои барномаҳои баландсифат мувофиқ нест.
Полимеразаи платина ДНК барои оғози автоматии PCR қулай ва самаранок аст.Полимеразаи Platinum Taq ДНК аз полимеразаи рекомбинатии Taq DNA дар якҷоягӣ бо антителоҳои моноклоналӣ бар зидди полимеразаи Так ДНК иборат аст.Антиденоҳо тавассути ПТР барои ҷилавгирӣ аз фаъолияти ферментҳо ҳангоми нигоҳдории дарозмуддати ҳарорат таҳия карда мешаванд.Полимеразаи Taq DNA ба реаксия ҳангоми изолятсияи 94 ℃ қадами денатуратсия баромад ва фаъолияти пурраи полимеразро барқарор кард.Дар муқоиса бо полимеразаи кимиёвӣ тағирёфтаи Taq DNA барои оғози гармӣ, ферментҳои платина барои фаъол кардани полимераз изолятсияи дарозмуддатро дар 94 ℃ (10 то 15 дақиқа) талаб намекунад.Бо полимеразаи PlatinumTaq DNA 90% фаъолияти полимеразаи Taq DNA пас аз 2 дақиқа дар 94℃ барқарор карда шуд.
11. Nest-PCR
Давраҳои пайдарпайи тақвият бо истифода аз праймерҳои лона метавонанд мушаххасот ва ҳассосиятро беҳтар кунанд.Даври аввал як амплификацияи стандартии аз 15 то 20 давра мебошад.Қисмати ками маҳсулоти ибтидоии пурқувват аз 100 то 1000 маротиба илова карда шуд ва ба даври дуюми пурқувваткунӣ барои 15 то 20 давра илова карда шуд.Интихобан, маҳсулоти ибтидоии пурқувватшуда метавонад тавассути тозакунии гел андоза карда шавад.Дар даври дуюми пурқувваткунӣ як праймери лона истифода мешавад, ки метавонад ба пайдарпаии ҳадаф дар дохили праймери аввал пайваст шавад.Истифодаи PCR-и лона имкони тақвияти сайтҳои сершумори мақсаднокро коҳиш медиҳад, зеро шумораи ками пайдарпаии ҳадафҳо ба ҳарду маҷмӯи праймерҳо илова карда мешаванд.Шумораи умумии давраҳо (30 то 40) бо ҳамон праймерҳо маконҳои ғайримуқаррариро афзоиш доданд.PCR-и лона ҳассосияти пайдарпаии ҳадафҳои маҳдудро (масалан, mrnas нодир) зиёд мекунад ва хосияти PCRS-и душворро беҳтар мекунад (масалан, 5′ RACE).
12. Пастшавии PCR
Пастшавии PCR хусусиятро бо истифода аз шароити сахти тозакунӣ барои чанд давраи аввали ПЗР беҳтар мекунад.Давра дар ҳарорати гармкунӣ тақрибан 5℃ зиёдтар аз Tm тахминӣ оғоз меёбад, пас ҳар як давра аз 1℃ то 2℃ кам карда мешавад, то даме ки ҳарорати гармкунӣ аз Tm 5℃ паст шавад.Танҳо қолаби таъинот бо гомологияи баландтарин тақвият дода мешавад.Ин маҳсулотҳо дар давраҳои минбаъда васеъ мешаванд ва маҳсулоти ғайримуқаррариро аз байн мебаранд.Пастшавии PCR барои усулҳое муфид аст, ки дараҷаи гомологияи байни праймер ва қолаби мақсаднок маълум нест, ба монанди изи ангуштони ДНК AFLP.
Маҷмӯаҳои марбут ба PCR
Қаҳрамони 2 × PCRTMСистемаи омехта нисбат ба системаи оддии PCR Mix таҳаммулпазирии баландтар ба ингибиторҳои PCR дорад ва метавонад ба осонӣ бо тақвияти PCR-и қолибҳои гуногуни мураккаб мубориза барад.Системаи беназири реаксия ва самаранокии баланди Taq Hero вокуниши PCR-ро водор мекунад, ки самаранокии баландтар, хосият ва ҳассосият дошта бошад.
Самаранокии баландтари тақвият
Он дорои фаъолияти 5'→3' ДНК полимераза ва 5'→3' экзонуклеаза, бе фаъолияти экзонуклеаза 3'→5'.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Мушаххас - буфери оптимизатсияшуда ва ферменти гарми Taq метавонад тақвияти ғайримуқаррарӣ ва ташаккули димерҳои праймерро пешгирӣ кунад
Ҳассосияти баланд - метавонад нусхаҳои пасти қолабро ошкор кунад
Маҷмӯа реагенти беназири транскрипсияи баръакси Foregene ва DNA Polymerase Foregene HotStar Taq-ро дар якҷоягӣ бо системаи беназири реаксия истифода мебарад, то самаранокии тақвият ва хосияти реаксияро самаранок беҳтар кунад.
Вақти фиристодан: 09-09-2023
