RT-qPCR таҷрибаи асосии биологияи молекулавӣ аст ва ҳама бояд бо он шинос бошанд.Он асосан се марҳиларо дар бар мегирад: истихроҷи РНК, транскрипсияи баръакс ба cDNA ва PCR-и миқдории флуоресцентӣ дар вақти воқеӣ.Ифода намекунад, чй мешавад?Эҳтимол дорад, ки мушкилоте вуҷуд дорадтаҷрибаи транскрипсияи баръакс!Гарчанде ки чунин ба назар мерасад, ки таҷрибаи транскрипсияи баръакс танҳо бояд илова кардани RNA, dNTP, праймерҳо ватранскриптазаи баръаксба найчаи центрифуга ва хуб омехта кардан лозим аст, вале дар процесси амалии кор хануз бисьёр тафсилотхое хастанд, ки ба онхо диккат додан лозим аст.Биёед дар бораи он маълумот гирем!

Сифати РНК-ро чӣ тавр баҳо додан мумкин аст?
Барои ба даст овардани cDNA, сифати РНК муҳим аст!Сифати РНК-ро асосан аз ду ҷиҳат муайян кардан мумкин аст:
(1) якпорчагии РНК:Якчандии РНК-ро тавассути электрофорези гели агарозӣ тафтиш кардан мумкин аст. Эукариотҳоро мисол гирем, маҷмӯи пурраи РНК дорои се банди равшан аст, вазнҳои молекулавӣ аз калон то хурд 28S, 18S ва 5S мебошанд ва 28S аз 18S ду маротиба равшантар аст;агар се банд дида шавад, аммо навъи банд норавшан аст ё Диффузия маънои онро дорад, ки РНК қисман таназзул шудааст.Дар айни замон, лутфан реаксияи транскрипсияи баръаксро фавран иҷро кунед ва вуруди қолабро ба таври мувофиқ зиёд кунед;агар танҳо як банд бо вазни хурди молекулавӣ ё банд дида нашавад, РНК комилан таназзул кардааст ва бояд дубора истихроҷ карда шавад.Agilent 2100 якпорчагии РНК-ро бо диаграммаи қулла ва арзиши RIN нишон медиҳад.Агар кислотаи нуклеинӣ солим бошад, хатти асосии электроферограмма ҳамвор аст;агар кислотаи нуклеинӣ ба таври ҷиддӣ таназзул шавад, хатти асосӣ нобаробар аст ва қуллаҳои таназзул бештар пайдо мешаванд;арзиши RIN якпорчагии РНК-ро дар доираи 0-10 инъикос мекунад, арзиши РНК ҳар қадар калонтар бошад, сифати РНК ҳамон қадар беҳтар мешавад.Хуб, дараҷаи пуррагӣ ҳамон қадар баландтар аст.
(2) тозагии РНК:Таносуби OD260/280-ро тавассути спектрофотометрияи ултрабунафш муайян кардан мумкин аст.Агар таносуби OD260/280 аз 1,9 то 2,1 бошад, тозагӣ хеле хуб аст.
ДНК-и геномии боқимонда метавонад ба натиҷаҳои нодурусти миқдорӣ оварда расонад
Вақте ки РНК истихроҷ карда мешавад, РНК-и мо гирифта метавонад бо ДНК-и геномӣ (gDNA), ки тоза нашудааст, омехта шавад.Аз ин рӯ, cDNA пас аз транскрипсияи баръакс низ бо омехта карда мешавадгДНК.Дар ҷараёни поёнобqPCRреаксия,cDNAва gDNA метавонад ҳамзамон пурзӯр карда шавад, ки дар натиҷа арзиши нисбатан хурди CT ба вуҷуд меояд, бинобар ин натиҷаҳо метавонанд ғаразнок бошанд.
Пас, дар ин вазъият мо бояд чӣ кор кунем?Фориҷӣпешниҳод мекунад:
(1) Тозакунии геномро дар РНК баръакс анҷом диҳед, ки онро тавассути истихроҷи сутун ҳангоми истихроҷи РНК хориҷ кардан мумкин аст;
(2) РНК-и истихроҷшударо бо DNase коркард кунедI , аммо онро бо EDTA қатъ кунед;
реагентҳои транскрипсияи баръаксбо модулҳои тозакунии геном;

Чӣ тавр интихоб кардани праймерҳо барои транскрипсияи баръакс?
Примерҳои транскрипсияи баръакс инчунин ба натиҷаи реаксияи транскрипсияи баръакс таъсир мерасонанд.Шумо метавонед примерҳои тасодуфӣ, Oligo dT ё примерҳои мушаххаси генро барои транскрипсияи баръакс мувофиқи ҳолатҳои мушаххаси таҷриба интихоб кунед:
(1) Транскриптҳои мушаххас: праймерҳои мушаххаси ген тавсия дода мешаванд;
(2) Транскриптҳои порчаҳои дароз: Oligo dT/праймерҳои хоси ген тавсия дода мешаванд;
(3) Порчаҳои дохилии транскриптҳои сегменти дароз: праймерҳои мушаххаси ген/праймерҳои тасодуфӣ /праймерҳои тасодуфӣ + Oligo dT.Агар озмоиши минбаъдаи qPCR анҷом дода шавад, Oligo dT-ро танҳо истифода бурдан мумкин нест, зеро танҳо истифодаи Oligo dT метавонад боиси 3′-и охири ғаразнок гардад, ки ба натиҷаҳои нодурусти таҷрибаи qPCR оварда мерасонад;
(4) миРНК: Примерҳои ҳалқаи поя ё праймерҳои думдорро истифода бурдан мумкин аст.

Маҳсулоти транскрипсияи баръакс cDNA-ро барои муайян кардани миқдор чанд маротиба бояд ҳал кард?
Пас аз ба даст овардани cDNA-и маҳсулоти транскрипсияи баръакс, чанд маротиба cDNA бояд барои таҷрибаҳои qPCR ҳал карда шавад, хеле муҳим аст.Агар консентратсияи cDNA хеле баланд ё хеле паст бошад, ба самаранокии амплификация таъсир расонида метавонад.Оё консентратсияи cDNA-ро чен кардан мумкин аст ва онро чӣ гуна бояд кард?
(1) Консентратсияи cDNA-и маҳсулоти транскрипсияи баръаксро чен кардан мумкин нест, зеро ба ғайр аз маҳсулоти cDNA, маҳсулоти транскрипсияи баръакс инчунин дорои буфери боқимондаи транскрипсияи баръакс, транскриптазаи баръакс, праймерҳо ва ғайра мебошад, ки ба натиҷаҳои ченкунии консентратсия халал мерасонанд ва боиси OD260/280 мешаванд, таносуби OD260/280, таносуби OD260/D дуруст нест.Дар ин вақт баъзе дӯстон мегӯянд, пас ман консентратсияи пас аз тозакунӣ чен мекунам;Дар ин ҷо, Foregene хотиррасон кардан мехоҳад, ки cDNA-ро тоза кардан тавсия дода намешавад, зеро дарозии cDNA-и бо бозгашт ба даст омада гуногун аст ва cDNA-и кӯтоҳ ҳангоми тозакунӣ гум мешавад.
(2) Пас чӣ бояд кард?Пеш аз озмоиши qPCR, градиенти ҳалкунии cDNA-ро тавассути озмоиши пешакӣ муайян кардан мумкин аст.Масалан: маҳлули саҳомии cDNA, маҳлули 10-карата ва 100-карата маҳлулро ҳамчун қолибҳо барои таҷрибаҳои qPCR истифода баред ва омили ҳалкунандаро бо арзиши CT дар диапазони 18-28 интихоб кунед.

Чӣ тавр miRNAs бояд баръакс транскрипсия карда шаванд?
miRNA як РНК молекулаи хурди якқатор аст, ки андозаи тақрибан 22 нтро ташкил медиҳад, ки барои сафеда рамзгузорӣ намекунад.Аз сабаби дарозии кӯтоҳи он, усули анъанавии qPCR барои мустақиман муайян кардани он душвор аст, аз ин рӯ аксар вақт васеъ кардани miRNA лозим аст;усулҳои транскрипсияи баръакс барои miRNA, ки маъмулан истифода мешаванд, усули ҳалқа ва усули думдорро дар бар мегиранд.
Усули ҳалқаи поя ин васеъ кардани miRNA тавассути илова кардани праймерҳои ҳалқа мебошад.Ин усули ошкор ҳассосият ва хосияти баландтар дорад, аммо гузариши ошкор паст аст.Як транскрипсияи баръакс метавонад танҳо як miRNA ва истинодҳои дохилиро ошкор кунад;усули илова кардани дум аз ду иборат аст Он бо амали муштараки ду фермент, ки полимерази ПолиА ва транскриптазаи баръакс мебошанд, ба итмом мерасад.Полимераза барои илова кардани думҳои PolyA ба miRNA барои зиёд кардани дарозии он масъул аст ва транскриптазаи баръакс реаксияи транскрипсияи баръаксро иҷро мекунад.Ин усул дорои қобилияти баланди муайянкунӣ мебошад ва метавонад дар як транскрипсияи баръакс якчанд miRNA ва истинодҳои дохилиро ошкор кунад, аммо ҳассосият ва хосият дар усули ҳалқаи поя паст аст.