Ҳама дар бораи принсипи таҷрибаи qRT-PCR, тарҳрезии праймер, тафсири натиҷаҳо ва ғайра ҳарф мезананд, аммо ман фикр мекунам, ки ман бояд бо шумо амалиёти таҷрибавии qRT-PCR мубодила кунам.Ин хурд аст, аммо дар бораи натиҷаҳо.
Пеш аз иҷрои qRT-PCR, мо бояд дар бораи RNA ва усулҳои амалиётии худ фаҳмиши дақиқ дошта бошем.Охир саъю кушиши мо на фацат машк кардан, балки барои ба даст овардани натичахо нигаронида шудааст.Пас, пеш аз иҷрои qRT-PCR, мо бояд масъалаҳои зеринро муайян кунем (баъзе аз онҳо танҳо ба SYBR дахл доранд).
1 Оё боварӣ доред, ки РНК-и шумо вайрон нашудааст?
NanoDrop 2000 метавонад танҳо консентратсия ва тозагии РНК-ро муайян кунад, аммо якпорчагии РНК-ро муайян карда наметавонад.
Қимати RNA (RNA Intesity Number) метавонад якпорчагии РНК-ро инъикос кунад, ки онро системаи биоанализери Agilent 2100 муайян мекунад.
Расм. Диаграммаи схематикии арзишҳои RIN барои намунаҳои гуногуни РНК (эукариотҳо)
Аммо, лабораторияҳо одатан Agilent 2100 Bioanalyzer надоранд.Дар ин ҳолат мо метавонем тавассути гели формальдегид муайян кунем, аммо талабот ба миқдори умумии РНК зиёд аст, аз ин рӯ усули зудтарин истифодаи электрофорези оддии гел мебошад.Дар муҳити бенуклеаз будан лозим аст, аз ин рӯ зарфи электрофорез, шишаи зот, кронштейн gel ва шонаро бо оби DEPC шустан лозим аст.Агароза инчунин аз нуклеаза озод аст (то даме ки он нав кушода шудааст) ва буфери боркунӣ бояд то ҳадди имкон тоза бо 1,2% гел кушода шавад.
Аҳамият диҳед, ки гел бояд пурра гудохта шавад, вагарна он боиси бандҳои якхела мегардад, тавре ки дар намунаи 9 дар расм нишон дода шудааст.Агар шиддат аз ҳад зиёд баланд бошад ё муддати тӯлонӣ кор кунад, гармӣ тавлид мекунад ва боиси таназзули РНК мегардад, бинобар ин шиддат ва вақт бояд оқилона назорат карда шавад.Илова бар ин, ҷараёни гел метавонад минбаъд муайян кунад, ки оё дар намуна боқимондаи ДНК мавҷуд аст ё не ва мушоҳида кунед, ки оё дар чоҳи тақсимкунӣ миқдори зиёди бандҳои нигоҳ дошташуда вуҷуд дорад.
Расм.Муайян кардани электрофорези гелии РНК
2 Оё шумо дар бораи консентратсияи cDNA-и худ боварӣ доред?
Тачрибаи бародарони калон дар лаборатория аз он иборат аст, ки cDNA-и системаи 20 ul, ки бо хар як инверсия ба даст омадааст, бевосита 20X, дар ҳоле ки хоҳарони баъд аз докторӣ 10X маҳлул карда мешаванд.Ман одатан аз вазъият вобастаам.Азбаски сифати РНК, ки ҳар як шахс зикр кардааст, гуногун аст, сатҳи бозгашт низ гуногун аст ва технологияи бозгашт метавонад устувор набошад.
Ҳамин тавр, ҳар дафъае, ки ман cDNA-и баръаксро ба даст меорам, ман аввал онро тақрибан 3 маротиба ҳал мекунам ва сипас гени хоҷагидориро барои анҷом додани RT-PCR истифода мебарам, шумораи давраҳо умуман 25 давраро ташкил медиҳад, то консентратсияи мушаххасро муайян кунад ва сипас омили ниҳоии маҳлулро муайян кунад.
3 Оё боварӣ доред, ки праймерҳои шумо барои истифода осонанд?
Он метавонад хатти обшавии qRT-PCR гузарад, аммо ин ба ҳар ҳол пулро талаб мекунад.Барои лабораторияҳои бе пули зиёд, вақте ки онҳо праймерҳои зиёд мегиранд, онҳо метавонанд аз RT-PCR оддӣ истифода баранд, то бубинанд, ки оё он як банд аст ва мушаххасоти праймерҳоро муайян мекунад.Агар лаборатория пул кам накунад, хусусияти ҳама праймерҳоро як маротиба тавассути хатти обшавӣ муайян кардан мумкин аст.
4 Оё мутмаин ҳастед, ки шароити таҷрибавии шумо мувофиқ аст?
SYBR бояд аз нури қавӣ муҳофизат карда шавад, аз ин рӯ ҳангоми илова кардани реагенти SYBR кӯшиш кунед, ки чароғи болоиро хомӯш кунед ва барои анҷом додани он танҳо нури хира истифода бурдан лозим аст.
SYBR -ро дар ҳарорати 4 ° C нигоҳ доред.Ҳангоми истифода, хушхӯю ба боло ва поён гардонед, то хуб омехта кунед, то кафк нашавед ва сахт гирдоб накунед.
Баъзе хоҳарони хурдсол аз тарси омехта кардани намунаҳо дар тахтаи ПТР аломат кашиданро дӯст медоранд, ки ин нодуруст аст.Азбаски маркерҳои шумо эҳтимоли зиёд ба ҷамъоварии сигналҳои флуоресцентӣ таъсир мерасонанд, ман умуман ба наврасон тавсия медиҳам, ки ноутбукҳои таҷрибавӣ барои кӯмак дар хотира истифода баранд, тавре ки дар зер нишон дода шудааст.
Расм.Диаграммаи боркунии намунаи qRT-PCR
5 Оё боварӣ доред, ки шумо ин корро дуруст мекунед?
Ҳатман дастпӯшак пӯшед, дастпӯшак пӯшед, дастпӯшак пӯшед ва се маротиба чизҳои муҳимро бигӯед.
Барои кам кардани таъсири SYBR ба рӯшноӣ, ман шахсан мехоҳам аввал як қолабро илова кунам, тавре ки дар расми зер нишон дода шудааст.Тибқи таҷриба, илова кардани миқдори ками қолаб эҳтимол боиси хатогиҳои интихоб мегардад.Аз ин рӯ, барои кам кардани хатогие, ки дар натиҷаи илова кардани миқдори ками қолаб ба вуҷуд омадааст, ман одатан намунаро дубора дучанд мекунам ва ҳангоми илова кардани намуна барои кам кардани миқдори H2O2 миқдори иловашударо ду баробар зиёд мекунам.
Расм.Диаграммаи схемавии боркунии qRT-PCR
Сипас системаи qRT-PCR-ро ба таври зерин танзим кунед.
Расм.Диаграммаи омодасозии системаи qRT-PCR
ЭЗОҲ: Раванди конфигуратсия бояд дар ях анҷом дода шавад.
Пас аз илова кардани намуна, плёнкаи шаффофи мӯҳрро часбонед.Кӯшиш кунед, ки ба рӯи плёнкаи мӯҳркунандаи шаффоф бо дастони худ нарасонед, танҳо аз фазои ҳар ду тарафи филм амал кунед.Зеро изи ангуштҳо инчунин метавонанд ба ҷамъоварии сигналҳои флуоресцентӣ таъсир расонанд.Сипас центрифугаро истифода баред, то дар давоми 10 сония бо суръати паст зуд центрифуга кунед, то намуна дар девор овезон нашавад.
Маҳсулоти марбут:
Вақти фиристодан: апрел-28-2023
