Таҷрибаи RT-qPCR истихроҷи РНК ва арзёбии сифат, транскрипсияи баръакс ва qPCR се марҳиларо дар бар мегирад, ҳар як қадам чораҳои эҳтиётии зиёд дорад, мо дар зер муфассал муаррифӣ хоҳем кард.

Ⅰ.Арзёбии сифати RNA

Дар таҷрибаи RT-qPCR, пас аз ба итмом расидани истихроҷи РНК, сифати РНК бояд арзёбӣ карда шавад ва озмоиши минбаъда танҳо пас аз тахассуси он гузаронида мешавад.Усулҳои арзёбӣ спектрофотометр, электрофорези gel Agilent, таҳлили Agilent 2100 мебошанд, ки дар байни онҳо спектрофотометр бештар истифодашаванда ва усули муайянкунии электрофорези гели агарозӣ мебошанд.Бояд қайд кард, ки ин ду усулро барои анҷом додани ошкор ва таҳлили консентратсияи РНК, покӣ ва якпорчагӣ якҷоя истифода бурдан лозим аст, то сифати РНК таъмин карда шавад.

Маҷмӯаи изолятсияи РНК алоқаманд: 

Маҷмӯаи изолятсияи умумии RNA ҳуҷайра

Дар давоми 11 дақиқа аз ҳуҷайраҳои гуногуни парваришшуда РНК-и хеле тозашуда ва баландсифатро гирифтан мумкин аст.

Маҷмӯаи изолятсияи умумии RNA Animal

Аз бофтаҳои гуногуни ҳайвонот РНК-и умумии тоза ва хушсифатро зуд ва самаранок истихроҷ кунед.

Спектрофотометр:

Спектрофотометр асосан барои муайян кардани консентратсияи РНК ва тозагии РНК истифода мешавад, аммо вай тамомияти РНК ва боқимондаи геномиро муайян карда наметавонад.Дар байни онҳо, A260/280 ва A260/230 параметрҳои муҳим барои муайян кардани тозагии РНК мебошанд ва тозагии РНК-ро мувофиқи тағирёбии арзишҳои онҳо муайян кардан мумкин аст:

1. 1,9< A260/280< 2,1, ки покии РНК хуб аст;A260/280<1,9, нишон медиҳад, ки дар РНК боқимондаи сафеда вуҷуд дорад;A260/280>2.1, ки таназзули эҳтимолии қисман РНК-ро нишон медиҳад, ки онро бо электрофорези гели агарозӣ минбаъд тасдиқ кардан мумкин аст.

2. 2,0< A260/230< 2,2, нишон медиҳад, ки тозагии РНК хуб аст;A260/230< 2.0, нишон медиҳад, ки метавонад боқимондаҳои реагентҳои органикӣ дар РНК, ба монанди фенолҳо, этанол ё қанд мавҷуд бошанд.

Агароз гел электрофорез:

Таҳлили электрофорези агарози гел метавонад якпорчагии РНК, геном ва боқимондаҳои сафедаҳоро таҳлил кунад, аммо консентратсияи РНК-ро дақиқ муайян карда наметавонад ё пасмондаҳои реагентҳои органикиро муайян кунад.Масалан, қолабҳои РНК-и эукариотӣ гиред:

1. РНК электрофорези гели агарозӣ гузаронида шуд.Агар дар харитаи gel танҳо се банди ягонаи 28sRNA, 18sRNA ва 5.8sRNA мавҷуд бошад, ин нишон медиҳад, ки РНК-и истихроҷшуда солим аст.Агар падидаи кашолакунӣ вуҷуд дошта бошад, ин таназзули қисман РНК-ро нишон медиҳад.

2. Агар дар байни сӯрохи ширеш ва банд 28sRNA як банди дурахшон вуҷуд дошта бошад, метавонад боқимондаи ДНК-и геномӣ бошад.

3. Агар дар сӯрохии ширеш бандҳо пайдо шаванд, ин нишон медиҳад, ки метавонад боқимондаҳои сафеда ва дигар моддаҳои макромолекулярӣ мавҷуд бошад.

Ⅱ. Транскрипсияи баръакс

Пас аз ба итмом расидани истихроҷи РНК, он бояд ба cDNA барои таҷрибаҳои минбаъда баргардонида шавад, бинобар ин қадами баргардонидан муҳим аст.Транскрипсияи баръакс аз интихоби транскриптаза ва праймери баръакс ҷорӣ карда мешавад:

Интихоби транскриптазаи баръакс:

Транскриптазаҳои баръакси маъмулӣ AMV RTase ва MMLV RTase мебошанд.RNase H аз AMV RTase дорои фаъолияти қавӣ, дарозии кӯтоҳи синтез, миқдори ками синтез ва устувории хуби гармӣ (42 ~ 55 ℃) мебошад.Фаъолияти RNase H-и MMLV RTase заиф аст, дарозии синтез дароз аст, миқдори синтез баланд аст ва устувории гармӣ заиф аст (37 ~ 42 ℃).

Азбаски ферменти RNase H дорои функсияи таназзули қолаби РНК мебошад, MMLV бо фаъолияти сусти RNase H ҳангоми транскрипсияи баръакс бояд афзалият интихоб карда шавад ва пас аз муҳандисии генетикии дертар устувории гармии MMLV ба ҷаҳиши сифатӣ расид.Гирифтани ForegeneТранскриптазаи пешина (M-MLV барои транскрипсияи баръакс) ҳамчун мисол, он як транскриптазаи нави баръакс мебошад, ки дар бактерияҳои муҳандисии E. coli бо истифода аз технологияи рекомбинатсияи генетикӣ ифода ёфтааст.Он полимеразаи рекомбинатии ДНК мебошад, ки як риштаи ДНК-и комплементариро аз РНК, ДНК ё гибриди РНК: ДНК синтез мекунад.Он дорои фаъолияти RNase H, устувории қавӣ, наздикии қавии РНК ва ҳассосияти баланди ошкоркунӣ надорад.

 

Транскриптазаи пешина (M-MLV барои транскрипсияи баръакс)

Интихоби праймер:

Одатан праймерҳои RT ба се категория тақсим мешаванд: олиго dT, праймерҳои тасодуфӣ ва праймерҳои ба ген хос.Примерҳои мувофиқро барои истифода мувофиқи талаботи гуногуни таҷрибавӣ интихоб кунед.

1. Агар қолаб пайдоиши эукариотӣ бошад ва дер cDNA барои тақвияти муқаррарии ПТР истифода шавад, Oligo (dT) тавсия дода мешавад;Агар таҷрибаи минбаъда танҳо барои qPCR истифода шавад, Oligo (dT) тавсия дода мешавад, ки бо праймерҳои тасодуфӣ омехта карда шавад, то самаранокии транскрипсияи баръакс беҳтар карда шавад.

2. Агар қолаб аз прокариотҳо бошад, барои транскрипсияи баръакс бояд праймерҳои тасодуфӣ ё генҳои мушаххас интихоб карда шаванд.

Ⅲ.qPCR

Миқдори флуорессенсия асосан аз интихоби усулҳои миқдорӣ, принсипҳои тарҳрезии ибтидоӣ, интихоби ROX, конфигуратсияи системаи реаксия ва танзими шароити реаксия ва ғайра таҳия карда мешавад.

Интихоби усулҳои миқдорӣ:

Усулҳои миқдорӣ ба усулҳои нисбии миқдорӣ ва усулҳои мутлақ тақсим мешаванд.Миқдори нисбӣ метавонад барои муайян кардани таъсири усулҳои муайяни табобат ба ифодаи генҳо, муайян кардани фарқияти ифодаи генҳо дар вақтҳои гуногун ва муқоисаи фарқияти ифодаи генҳо дар бофтаҳои гуногун истифода шавад.Миқдори мутлақ метавонад миқдори кислотаи нуклеинро дар вирус ва ғайра муайян кунад.Ҳангоми гузаронидани таҷрибаҳо мо бояд аз рӯи таҷрибаҳои худамон усулҳои мувофиқи миқдорӣ интихоб кунем.

Принсипҳои тарҳрезии ибтидоӣ:

Тарҳрезии праймер барои qPCR мустақиман ба самаранокии тақвият ва хосияти маҳсулот вобаста аст.Аз ин рӯ, тарҳрезии дурусти праймерҳои хуб қадами аввалини муваффақонаи qPCR мебошад.Ҳангоми тарҳрезии праймер ҳангоми мувофиқат ба принсипи тарроҳии анъанавӣ бояд ба принсипҳои зерин диққат дод:

1. Дарозии порчаи мақсаднок аз 100 то 300 bp идора карда мешавад;

2. Тарҳрезии кросс-эксон барои пешгирӣ аз таъсири ДНК-и геномӣ;

3. Примерҳои тарҳрезишуда бояд барои самаранокии пурқувваткунӣ санҷида шаванд ва танҳо вақте ки самаранокии пурқувваткунӣ ба стандарт (90-110%) мерасад, онҳоро барои таҷрибаҳои миқдорӣ истифода бурдан мумкин аст;

4. Консентратсияи Primer одатан байни 0.1uM ва 1.0uM оптимизатсия карда мешавад.

ИнтихобиROX:

Дар ҷараёни реаксияи миқдорӣ, ROX метавонад фарқияти роҳи оптикӣ, хатогии пиптинг ё фарқияти ҳаҷмро, ки дар натиҷаи бухоршавӣ ва конденсатсия ба вуҷуд омадааст, яксон танзим карда, такроршавандагии натиҷаҳоро беҳтар созад.Аммо, бояд қайд кард, ки интихоби ROX ба асбоб вобаста аст.Агар асбоби qPCR функсияи ба таври худкор ислоҳ кардани фарқияти байни сӯрохиҳоро дошта бошад, ба он илова кардани ROX лозим нест;дар акси ҳол, он бояд ислоҳи ROX-ро илова кунад.Шарикони хурд дар хариди реагентҳо бояд мувофиқи асбобе, ки барои интихоби дурусти ROX истифода мешаванд, бошанд, аз хатогиҳои баъдӣ канорагирӣ кунанд.

Омодасозии системаи реаксия:

Ҳаҷми реаксия 20ul ва 50ul афзалтар аст.Ҳангоми таҳияи система ба масъалаҳои зерин диққат додан лозим аст:

1. Системаи реаксия бояд бо роҳи вентилятсия дар коргоҳи ултра тоза, ddH нав омода карда шавад.₂О барои ҳар як таҷриба истифода мешавад;

2. Ҳар як озмоиш бояд NTC-ро омода кунад, то тафтиш кунад, ки оё дар система ифлосшавӣ вуҷуд дорад ва ҳар як ҷуфти ибтидоӣ ҳангоми омода кардани система бояд NTC-ро иҷро кунад;

3. Барои муайян кардани он ки оё дар қолаби РНК боқимондаи gDNA мавҷуд аст, NRT-ро барои ҳар як намуна барои муайян кардан омода кардан мумкин аст;

4. Ҳангоми тайёр кардани система, тавсия дода мешавад, ки барои як намуна ҳадди аққал 3 такрори техникӣ анҷом дода шавад;

5. Вақте ки қолаб cDNA аст, тавсия дода мешавад, ки 5-10 маротиба илова карда шавад, то таъсири монеъшавии системаи транскрипсияи баръакс дар таҷрибаи qPCR кам карда шавад.Беҳтар аст, ки миқдори қолабро аз рӯи градиент таҳқиқ кунед, то ки арзиши КТ байни 20-30 афтад;

6. Миќдори зарурии реаксияњоро муайян намуда, аз рўи шумораи реаксияњо 5-10% зиёд карда, адади конфигуратсияи њаљмро њисоб кунед;

7, система бо истифода аз принсипи premix омода карда мешавад, омехта пас аз центрифуга ва таъмини ҳеҷ футури;

8, То ҳадди имкон интихоби масолеҳи дастгирӣ.

Маҷмӯаи марбут ба RT-qPCR