Хусусияти ошкор
Дар аксари ҳолатҳо, ҳадафи тарҳрезии праймер ба ҳадди аксар расонидани хосияти PCR мебошад.Ин аз ҷониби таъсири бештар ё камтар пешбинишавандаи бисёр тағирёбандаҳо муайян карда мешавад.Як тағирёбандаи муҳим пайдарпаӣ дар 3′-охири праймер мебошад.
Муҳим он аст, ки таҳлилҳои PCR, ки барои мушаххасият тарҳрезӣ шудаанд, эҳтимоли зиёд доранд, ки самаранокии баландро дар диапазони васеи динамикӣ нигоҳ доранд, зеро таҳлил маҳсулоти амплификацияи ғайримахсусро тавлид намекунад ва ба ин васила бо реагентҳои ПЗР рақобат мекунад ё реаксияи асосии амплификацияро бозмедорад.
Албатта, дар баъзе мавридҳо, мушаххасият муҳимтарин нест, масалан, вақте ки ҳадаф муайян кардани миқдори патогенҳои ба ҳам наздик, вале гуногун аст, стандартҳои махсус, оптимизатсия ва санҷиш талаб карда мешаванд.
Каҷи обшавӣ як усули стандартии арзёбии хосияти ампликонҳо мебошад, ҳадди аққал дар робита ба тақвияти як ҳадаф.Бо вуҷуди ин, бояд қайд кард, ки хатҳои обшавии об метавонад гумроҳкунанда бошад, зеро масалан, онҳо метавонанд аз таъсири якҷояи праймерҳои субоптималӣ ва консентратсияи пасти қолабҳо таъсир расонанд.
P5 |Каҷи обшавӣ тағирёбии Tm-ро нишон медиҳад, ки аз ду ошкор кардани миқдори гуногуни ду ДНК-и ҳадаф гирифта шудааст.
A. Дар консентратсияи баландтар (ad)), пас аз анҷоми андозагирии qPCR ягон димери баръало вуҷуд надорад.Вақте ки консентратсияи шаблон то 50 нусха кам мешавад (д), маҳсулоти ғайримуқаррарӣ пайдо шуданро оғоз мекунад ва ягона маҳсулот дар консентратсияи пасттарин мегардад (f).
B. Санҷиш ҳамон Tms-ро дар ҳама консентратсияи мақсаднок сабт кард ва ҳатто дар консентратсияи пасттарин (5 нусха) димери баръало вуҷуд надошт.Ҳангоми истифодаи ин ду усули муайянкунӣ, дар NTCҳо ягон маҳсулоти пурқувваткунӣ ошкор карда нашудааст.
P5 каҷҳои парокандаро, ки бо намунаҳо ба даст оварда шудаанд, нишон медиҳад, ки дар онҳо қолаб дар консентратсияи гуногун мавҷуд аст.Р 5а нишон медихад, ки дар ду кон-центрацияи пасттарин Tms-и махсулоти гайриспецифии амплификацияи истехсолшуда нисбат ба ампликонхои махсус пасттар аст.
Аён аст, ки ин усули ошкоркуниро барои муайян кардани ҳадафҳое, ки дар консентратсияи паст мавҷуданд, ба таври эътимодбахш истифода бурдан мумкин нест.
Ҷолиб он аст, ки NTCs, яъне намунаҳое, ки умуман ДНК надоранд, маҳсулоти амплификацияро (ғайри мушаххас) сабт накарданд, ки нишон медиҳад, ки ДНК-и геномии пасзаминӣ метавонад дар амплификация/полимеризатсияи ғайримуқаррарӣ иштирок кунад.
Баъзан чунин праймерҳои замина ва амплификацияи ғайримуқаррариро ислоҳ кардан ғайриимкон аст, аммо аксар вақт тарҳрезии усули муайянкуниро имконпазир аст, ки дар ҳама гуна консентратсияи шаблон ва NTC амплификацияи ғайримуқаррарӣ надошта бошад (P 5b).
Дар ин ҷо, ҳатто сабти ампификацияи консентратсияи мақсаднок бо Cq 35 каҷи мушаххаси парокандаро ба вуҷуд меорад.Ба ҳамин монанд, NTCs ягон аломати тақвияти ғайримуқаррариро нишон надоданд.Баъзан, рафтори ошкор метавонад аз алкоголи модар вобаста бошад ва дар таркиби муайяни буферӣ танҳо амплификацияи ғайримуқаррарӣ муайян карда мешавад, ки метавонад ба консентратсияи гуногуни Mg2+ алоқаманд бошад.
Устувории ошкор
Оптимизатсияи Ta як қадами муфид дар раванди санҷиши эмпирикӣ ва оптимизатсияи муайянкунии qPCR мебошад.Он нишондиҳандаи мустақими устувории ибтидоии муқарраршударо тавассути нишон додани ҳарорат (ё диапазони ҳарорат), ки Cq пасттаринро бидуни тақвияти NTC тавлид мекунад, таъмин мекунад.
Тафовут аз ду то чор маротиба дар ҳассосият метавонад барои одамоне, ки ифодаи баланди mRNA доранд, муҳим набошад, аммо барои санҷишҳои ташхисӣ метавонад фарқияти байни натиҷаҳои мусбат ва бардурӯғи манфӣ дошта бошад.
Хусусиятҳои Ta-и праймерҳои qPCR метавонанд хеле фарқ кунанд.Баъзе санҷишҳо чандон устувор нестанд ва агар онҳо дар зери арзиши оптималии Ta -и праймерҳо иҷро нашаванд, онҳо зуд фурӯ хоҳанд рафт.
Ин муҳим аст, зеро ин навъи ошкор аксар вақт дар ҷаҳони воқеӣ мушкил аст ва покии намуна, консентратсияи ДНК ё мавҷудияти дигар ДНК метавонад беҳтарин набошад.
Илова бар ин, рақами нусхаи мақсаднок метавонад дар доираи васеъ фарқ кунад ва реактивҳо, зарфҳои пластикӣ ё асбобҳо метавонанд аз онҳое, ки ҳангоми насб кардани санҷиш истифода мешаванд, фарқ кунанд.
P6|Градиенти ҳарорат устувории гуногуни муайянкунии PCR-ро нишон медиҳад.
A. Мастермикси Sensifast SYBR Bioline-ро (рақами каталоги BIO-98050) истифода баред, то PCR дар cDNA аз РНК мағзи сари инсон омода карда шавад.
B. Истифодаи асбоби CFX qPCR Bio-Rad барои сабт харитаи пурзўртар ва каљ каљ аз apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Графикаи пурқувват ва хати обшавии ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Графикаи амплификация ва каҷи парокандашавии GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs дар ҳарорати гуногуни annealing сабт, нишон фарқияти Cq дар зери градиенти ҳарорати 7C сабт.
P 6 натиҷаи маъмулии санҷиши номатлубро нишон медиҳад, ки дар он qPCR бо истифода аз градиенти Tas байни 59C ва 67C (P 6a) бо истифода аз праймерҳо барои се гени мушаххаси майнаи инсон анҷом дода шудааст.
Аз графики амплификация дидан мумкин аст, ки праймерҳои Opalin аз идеал дур нестанд, зеро диапазони оптималии Ta хеле танг аст (Расми 6б), яъне Cqҳо ба таври васеъ пароканда шудаанд, ки дар натиҷа Cqҳо бо оптималии Cqs Low ба таври назаррас муқоиса карда мешаванд.
Ин усули муайянкунӣ ноустувор аст ва метавонад ба пурқувватшавии субоптималӣ оварда расонад.Аз ин рӯ, ин ҷуфти праймерҳо бояд аз нав тарҳрезӣ карда шаванд.Илова бар ин, тахлили каљи обшавии (дохилшуда) нишон медињад, ки хусусияти ин усули муайянкунанда низ метавонад мушкил бошад, зеро каљ обшавии њар як Ta гуногун аст.
Усули муайянкунии ACSBG1, ки дар P 6c нишон дода шудааст, нисбат ба усули муайянкунии Opalin дар боло устувортар аст, аммо он ҳанӯз аз идеал дур аст ва эҳтимол дорад, ки онро такмил додан мумкин аст.
Бо вуҷуди ин, мо таъкид менамоем, ки байни устуворӣ ва хосият ягон робитаи зарурӣ вуҷуд надорад, зеро хати каҷи пароканда, ки бо ин усули ошкор ҳосил шудааст, арзиши якхеларо дар ҳама Tas (дохилшуда) нишон медиҳад.
Аз тарафи дигар, санҷиши устуворӣ хеле таҳаммулпазир аст ва Cq-ҳои шабеҳро дар доираи васеи Tas ба вуҷуд меорад, тавре ки дар санҷиши GFAP дар P 6d нишон дода шудааст.
Тафовут дар Cqs, ки дар ҳамон диапазони 8 дараҷа Celsius ба даст оварда шудааст, камтар аз 1 аст ва каҷравии пароканда (дар дохил) хусусияти ошкоркуниро дар ин диапазони ҳарорат тасдиқ мекунад.Бояд қайд кард, ки Tas ҳисобшуда ва диапазони воқеии Ta метавонад хеле фарқ кунад.
Роҳнамои зиёде вуҷуд доранд, ки ба муҳаққиқон дар тарҳрезии праймерҳои муассир ёрӣ расонанд, ки аксари онҳо ба қоидаҳои дерини муқарраршуда асос ёфтаанд ва ба 3′ охири праймерҳо таваҷҷӯҳи зиёд дода шудааст.Аксар вақт тавсия дода мешавад, ки G ё C дар охири 3' ва ду пойгоҳи G ё C (тазиқи GC), аммо на бештар аз ду пойгоҳи охирини 5.
Дар амал, ин қоидаҳо метавонанд тадқиқотчиёнро роҳнамоӣ кунанд, аммо онҳо дар ҳама ҳолатҳо ҳатман дуруст нестанд.
P7 |3′-охири праймер ба мушаххасот ё самаранокӣ таъсири кам дорад.
A. Мавқеи праймерҳо барои гени HIF-1α (NM_181054.2) инсон.
B. Истифода Agilent Brilliant III SYBR Green модар алкогол (Кат. № 600882) барои пурзўр намудани шаш адад санҷиш.
C. Графикаи амплификация ва хати обшавии тавассути асбоби CFX qPCR Bio-Rad ва праймерҳои 3′-охири сабтшуда.NTC бо ранги сурх нишон дода шудааст.
D. Сабти Cqs ҳар як банди санҷиш
Масалан, натиҷа дар P 7 хилофи қоидаи 3′-охир аст.Ҳама тарҳҳо асосан якхела натиҷа медиҳанд ва танҳо ду комбинатсияи ибтидоӣ боиси тақвияти ғайримуқаррарӣ дар NTC мешаванд.
Бо вуҷуди ин, мо наметавонем таъсири клипи GC-ро дастгирӣ кунем, зеро дар ин ҳолат истифодаи A ё T ҳамчун ҳадди аксар 30 асос хусусиятро кам намекунад.
Санҷиши C, ки дар он праймери F дар GGCC ба охир мерасад, Cq-ро дар NTCҳо сабт кардааст, ки нишон медиҳад, ки касе метавонад аз ин пайдарпайиҳо дар охири 30 канорагирӣ кунад.Мо таъкид мекунем, ки ягона роҳи муайян кардани пайдарпаии беҳтарини 3′-охири ҷуфти ибтидоӣ ин баҳодиҳии баъзе праймерҳои номзад ба таври таҷрибавӣ мебошад.
Самаранокии тақвият
Муҳим он аст, ки ҳарчанд муайянкунии ғайримуқаррарии ПТР ҳеҷ гоҳ мушаххас шуда наметавонад, самаранокии пурқувватро бо роҳҳои гуногун тавассути тағир додани фермент, алкоголи модарӣ, иловаҳо ва шароити велосипедронӣ танзим ва ҳадди аксар кардан мумкин аст.
Барои арзёбии самаранокии муайянкунии ПТР беҳтар аст, ки аз 10 ё 5 маротиба аз кислотаи нуклеинҳои мақсаднок истифода баред, яъне "усули каҷи стандартӣ".
Агар ампликонҳои ПТР ё ҳадафҳои синтетикии ДНК барои тавлиди каҷи стандартӣ истифода шаванд, маҳлулҳои пайдарпайи ин ҳадафҳо бояд бо миқдори доимии ДНК замина (масалан, ДНК геномӣ) омехта карда шаванд.
P8 |Каҷи каҷ барои арзёбии самаранокии PCR.
A. Праймерҳоро барои HIF-1 истифода баред: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ва R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ва Mastermix Brilliant III SYBR Green (рақами каталоги 600882) барои PCR ва шароити обшавии каҷ.
B. 100 нг РНК баръакс транскрипсия карда шуд, 2 маротиба маҳлул карда шуд ва намунаҳои cDNA-и пайдарпай 5 маротиба ба 1 нг ДНК геномии инсон илова карда шуданд.Каҷи обшавӣ дар дохил нишон дода шудааст.
C. Реаксияи RT, маҳлул ва ҳалкунии силсилавӣ барои намунаи дуюми cDNA такрор карда шуд ва натиҷаҳо шабеҳ буданд.
P 8 ду каҷҳои стандартиро бо истифода аз як усули муайянкунӣ дар ду намунаи cDNA-и гуногун нишон медиҳад, натиҷа самаранокии якхела аст, тақрибан 100% ва арзиши R2 низ шабеҳ аст, яъне дараҷаи мувофиқат байни маълумоти таҷрибавӣ ва хати регрессия ё маълумот Дараҷаи хатӣ.
Ду хатти стандартӣ муқоисашавандаанд, аммо комилан якхела нестанд.Агар ҳадаф дақиқ муайян кардани миқдори ҳадаф бошад, бояд қайд кард, ки бидуни шарҳ додани номуайянӣ пешниҳоди ҳисобкунии рақами нусхабардорӣ ғайри қобили қабул аст.
P9 |Номайянии андозагирӣ, ки бо миқдорӣ бо истифода аз каҷи стандартӣ алоқаманд аст.
A. Праймерҳоро барои GAPDH (NM_002046) барои иҷрои ПТР ва обшавии шартҳои каҷ истифода баред.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ва R: TAACTGGTTGAGCACAGG ва Mastermix Sensifast SYBR Bioline (рақами каталоги BIO-98050).
B. Диаграммаи пурзӯркунӣ, каҷи обшавӣ ва каҷи стандартӣ бо асбоби CFX qPCR Bio-Rad сабт шудааст.
C. Графикаи каҷи стандартӣ ва фосилаи эътимоди 95% (CI).
D. Рақами нусхабардорӣ ва фосилаи 95% эътимоди се арзиши Cq, ки аз хати каҷӣ гирифта шудаанд.
P 9 нишон медиҳад, ки барои санҷиши оптимизатсияшуда тағирёбии хоси каҷи ягонаи стандартӣ тақрибан 2 маротиба аст (95% фосилаи эътимод, ҳадди ақал то ҳадди аксар), ки метавонад хурдтарин тағирёбанда бошад, ки интизор шудан мумкин аст.
Маҳсулоти марбут:
Маҷмӯаи PCR Direct Tissue Animal
Вақти фиристодан: сентябр-30-2021
