Маҷмӯаи Cell Direct RT qPCR—SYBR GREEN I Маҷмӯаҳои бевоситаи ҳуҷайраҳои лизиси ҳуҷайраи омодаи як қадами qRT-PCR
Тавсифҳо
Ин маҷмӯа як системаи беназири буферии лизисро истифода мебарад, ки метавонад РНК-ро аз намунаҳои ҳуҷайраҳои парваришшуда барои аксуламалҳои RT-qPCR зуд озод кунад ва ба ин васила раванди тозакунии РНК-ро аз байн мебарад.Шаблони РНК-ро танҳо дар 7 дақиқа ба даст овардан мумкин аст.5×Миксҳои мустақими RT ва 2×Реагентҳои мустақими qPCR Mix-SYBR, ки аз ҷониби маҷмӯа пешниҳод шудаанд, метавонанд зуд ва самаранок натиҷаҳои миқдорӣ дар вақти воқеӣ ба даст оранд.
5×Миксҳои мустақими RT ва 2×qPCR мустақими Mix-SYBR таҳаммулпазирии қавии ингибиторҳо дорад ва лизати намунаҳоро метавон мустақиман ҳамчун қолаби RT-qPCR истифода бурд.Ин маҷмӯа дорои транскриптазаи баръакси RNA-и баландсифати Foregene ва полимеразаи Hot D-Taq, dNTPs, MgCl мебошад.2, буфери реаксия, оптимизатори PCR ва стабилизатор.
Мушаххасоти
200×20μл Rxns, 1000×20μl Rxns
Компонентҳои комплект
| Қисми I | Буфери CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Буфери ST | |
| Қисми II | ДНК хаткӯркунак |
| 5 × Омехтаи мустақими RT | |
| 2 × мустақими qPCR Mix-SYBR | |
| 50 × Ранги истинод ROX | |
| RNase-Free ddH2O | |
| Дастурҳо | |
Хусусиятҳо ва афзалиятҳо
■Содда ва самаранок: бо технологияи Cell Direct RT, намунаҳои РНК-ро ҳамагӣ дар 7 дақиқа ба даст овардан мумкин аст.
■ Талаботи намунавӣ хурд аст, то 10 ҳуҷайраро санҷидан мумкин аст.
■ Қобилияти баланд: он метавонад РНК-ро дар ҳуҷайраҳои дар 384, 96, 24, 12, 6-чоҳҳо парваришшуда зуд муайян кунад.
■ DNA Eraser метавонад геномҳои озодшударо зуд тоза кунад ва таъсирро ба натиҷаҳои минбаъдаи таҷрибавӣ хеле кам кунад.
■ Системаи оптимизатсияшудаи RT ва qPCR транскрипсияи баръакси ду марҳилаи RT-PCR-ро самараноктар ва PCR-ро мушаххастар ва ба ингибиторҳои реаксияи RT-qPCR тобовартар мекунад.
Аризаи маҷмӯа
Доираи татбиқ: ҳуҷайраҳои парваришшуда.
- РНК тавассути лизиси намуна бароварда шудааст: танҳо ба қолаби RT-qPCR ин маҷмӯа татбиқ мешавад.
- Маҷмӯаро барои мақсадҳои зерин истифода бурдан мумкин аст: таҳлили ифодаи генҳо, санҷиши таъсири хомӯшкунии генҳои siRNA, скрининги маводи мухаддир ва ғайра.
Диаграмма
Нигоҳдорӣ ва мӯҳлати нигоҳдорӣ
Қисми I ин маҷмӯа бояд дар ҳарорати 4℃ нигоҳ дошта шавад;Қисми II бояд дар -20 ℃ нигоҳ дошта шавад.
Foregene Protease Plus II бояд дар 4 дараҷа нигоҳ дошта шавад℃, дар -20 ℃ ях накунед.
Реактив 2×qPCR Mix-SYBR мустақим бояд дар -20 нигоҳ дошта шавад℃дар торикӣ;агар зуд-зуд истифода бурда шавад, он метавонад дар 4 нигоҳ дошта шавад℃ барои нигоҳдории кӯтоҳмуддат (дар давоми 10 рӯз истифода мешавад).
Принсипҳои тарроҳии праймери PCR дар вақти воқеӣ
Праймери пеш ва праймери баръакс
Барои PCR Real Time тарҳрезии праймер хеле муҳим аст.Примерҳо ба хусусият ва самаранокии пурқувваткунии PCR алоқаманданд ва метавонанд бо истинод ба принсипҳои зерин тарҳрезӣ шаванд:
Дарозии ибтидоӣ: 18-30bp.
Мазмуни GC: 40-60%.
Арзиши Tm: Нармафзори тарроҳии Primer, ба монанди Primer 5, метавонад арзиши Tm-и праймерро диҳад.Қиматҳои Tm-и праймерҳои боло ва поён бояд ба қадри имкон наздик бошанд.Формулаи ҳисобкунии Tm низ метавонад истифода шавад: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Ҳангоми иҷрои ПЗР, одатан ҳамчун ҳарорати гармкунӣ ҳарорат аз арзиши ибтидоии Tm аз 5 °C интихоб карда мешавад (афзоиши мувофиқ дар ҳарорати гармкунӣ метавонад хусусияти реаксияи ПЗР-ро зиёд кунад).
Примерҳо ва маҳсулоти PCR:
Дарозии маҳсулоти афзояндаи праймери тарроҳии PCR беҳтараш 100-150б.
Праймерҳои тарроҳӣ дар минтақаи дуюмдараҷаи сохтории қолаб бояд то ҳадди имкон пешгирӣ карда шаванд.
Аз ташаккули 2 ё зиёда пойгоҳҳои иловагӣ дар байни 3′ охири праймерҳои болооб ва поёноб канорагирӣ кунед.
Пойгоҳи терминали Primer 3' наметавонад бо 3 пайдарпайи G ё C мавҷуд бошад.
Худи праймерҳо наметавонанд сохторҳои иловагиро дошта бошанд, вагарна сохтори мӯй ба вуҷуд меояд, ки ба тақвияти PCR таъсир мерасонад.
ATCG бояд ба қадри имкон дар пайдарпаии ибтидоӣ тақсим карда шавад ва аз пойгоҳи терминали 3' бояд ҳамчун T пешгирӣ карда шавад.
Замимаи 1: Бастаи иловагии ҷузъҳои Cell Direct RT-qPCR Kit
1.Маҳлули лизиси ҳуҷайра
|
| |||
| Компонентҳои комплект (24-чоҳ системаи лизис / чоҳ) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 Т | 500 Т | ||
| ҚисмиИ | Буфери CL | 20 мл | 100 мл |
| Foregene Protease Plus II | 400 мкл | 1 мл × 2 | |
| Буфери ST | 1 мл × 2 | 10 мл | |
| ҚисмиII | ДНК хаткӯркунак | 400 мкл | 1 мл × 2 |
2.RT Mix
|
| |
| Компонентҳои комплект (Системаи реаксия 20 мкл) | DRT-01011-B1 |
| 200 Т | |
| 5 × Омехтаи мустақими RT | 800 мкл |
| RNase-Free ddH2O | 1,7 мл × 2 |
|
| ||
| Компонентҳои комплект (Системаи реаксия 20 мкл) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 Т | 1000 Т | |
| 2 × мустақими qPCR Mix-SYBR | 1 мл × 2 | 1,7 мл × 6 |
| 50 × Ранги истинод ROX | 40 мкл | 200 мкл |
| RNase-Free ddH2O | 1,7 мл | 10 мл |
Дастурҳои дастурӣ:
