Стерилизатсияи нӯги пипеткаҳо ва қубурҳои EP ва ғайра.
1. 0,1% (ҳазорум) DEPC (моддаи хеле заҳрнок)-ро бо оби деионизатсияшуда омода кунед, онро бо эҳтиёт истифода баред ва дар ҳарорати 4°С дуртар аз рӯшноӣ нигоҳ доред;
Оби DEPC оби покест, ки бо DEPC коркард шуда, бо ҳарорати баланд ва фишори баланд стерилизатсия карда мешавад.Санҷида шудааст, ки аз RNase, DNase ва протеиназа озод аст.
2. Нӯги пипетка ва найчаи ДМ-ро ба 0,1% DEPC гузоред ва боварӣ ҳосил кунед, ки нӯги пипетка ва найчаи EP бо 0,1% DEP пур карда шудааст.
3. Аз рӯшноӣ муҳофизат кунед, бигзоред, як шабонарӯз (12-24 соат)
4. Қуттии дорои нӯг ва найчаи EP лозим нест, ки дар DEPC тар карда шавад.Пас аз тақрибан тоза кардани оби DEPC дар нӯг ё найчаи EP, онро бастабандӣ кунед ва печонед.
5. 121 дарача гарм, 30 дакика
6. 180 дараҷа гарм, якчанд соат хушк (на камтар аз 3 соат)
Эзоҳ: а.Ҳангоми коркарди DEPC дастпӯшакҳои латексӣ ва ниқобҳо пӯшед!б, ё бе стерилизатсияи DEPC, 130 ℃, 90 дақиқа автоклав (бисёр лабораторияҳо ду маротиба стерилизатсияи ҳарорати баланд)
Мулоҳизаҳои истихроҷи РНК
Ду зуҳуроти асосии нокомии ҷудокунии РНК бофта
таназзули РНК ва боқимондаҳои наҷосат дар бофтаҳо,дар мавриди таназзул, биёед аввал бубинем, ки чаро РНК-и аз ҳуҷайраҳои парваришшуда гирифташуда ба осонӣ таназзул намекунад.Реагентҳои мавҷудаи истихроҷи РНК ҳама ҷузъҳое доранд, ки RNase-ро зуд боздоранд.Лизатро ба ҳуҷайраҳои парваришшуда илова кунед ва онро танҳо омехта кунед, ҳамаи ҳуҷайраҳоро бо лизат бодиққат омехта кардан мумкин аст ва ҳуҷайраҳо пурра лиз мешаванд.Пас аз лизи ҳуҷайраҳо, компонентҳои фаъол дар лизат фавран RNase дохили ҳуҷайраро бозмедоранд, бинобар ин РНК бетағйир мемонад.Яъне, азбаски ҳуҷайраҳои парваришшуда бо лизат ба осонӣ ва пурра тамос мегиранд, РНК-и онҳо ба осонӣ вайрон намешавад;аз тарафи дигар, РНК дар бофта ба осонӣ вайрон мешавад, зеро ҳуҷайраҳои бофта зуд бо лизат тамос гирифтан осон нест.аз сабаби тамоси кофӣ.Пас,агар бо назардошти он, ки роҳи ба як ҳуҷайра табдил додани матоъ ҳангоми боздоштани фаъолияти РНК мавҷуд аст, мушкилоти таназзулро комилан ҳал кардан мумкин аст.
Парвариши нитрогени моеъ аз ҳама самараноктарин чунин усул аст.Бо вуҷуди ин, усули фрезеркунии нитрогени моеъ хеле душвор аст, хусусан вақте ки шумораи намунаҳо зиёд аст.Ин боиси беҳтарин чизи навбатӣ гардид: гомогенизатор.Даргомогенизаторусул саволеро дар бораи он ки чӣ гуна фаъолияти RNase пеш аз тамос бо лизат ба ҳуҷайраҳо монеъ мешавад, баррасӣ намекунад, балки дуо мекунад, ки суръати вайроншавии бофта нисбат ба суръате, ки RNase дохили ҳуҷайра RN-ро таназзул мекунад, тезтар аст.
Таъсири гомогенизатори электрикӣ беҳтар аст,ва таъсири гомогенизатори шиша суст аст, аммо дар маҷмӯъ, усули homogenizer метавонад падидаи таназзулро пешгирӣ кунад.Аз ин рӯ, агар истихроҷ вайрон шавад, гомогенизатори барқии аслии бояд барои дастос бо нитрогени моеъ истифода шавад;гомогенизатори аслии шиша бояд ба гомогенизатори электрикӣ иваз карда шавад ё бевосита бо нитрогени моеъ резед.Мушкилот қариб 100% имконпазир аст.ҳал шавад.
Мушкилоти боқимондаи наҷосат, ки ба таҷрибаҳои минбаъда таъсир мерасонад, нисбат ба таназзул сабабҳои гуногун дорад ва ҳалли онҳо мутаносибан гуногунанд.Хулоса,агар дар матоъ таназзул ё наҷосати боқимонда мавҷуд бошад, усули истихроҷ/реагенти маводи мушаххаси таҷрибавӣ бояд оптимизатсия карда шавад.Барои оптимизатсия ба шумо лозим нест, ки намунаҳои қиматбаҳои худро истифода баред: шумо метавонед аз бозор чанд ҳайвонҳои хурд, ба монанди моҳӣ/мурғро харед, қисми мувофиқи маводро барои истихроҷи РНК ва қисми дигарро барои истихроҷи сафеда гиред – бо даҳон, меъда ва рӯдаҳо резед.
РНК-и мақсадноки РНК-и истихроҷшуда барои таҷрибаҳои гуногуни минбаъда истифода мешавад ва талаботи сифати он гуногун аст
Сохтмони китобхонаи cDNA якпорчагии РНК-ро бидуни пасмондаҳои ингибиторҳои реаксияи ферментӣ талаб мекунад;Northern якпорчагии баландтари РНК ва талаботи пасти пасмондаҳои ингибиторҳои реаксияи ферментҳоро талаб мекунад;RT-PCR якпорчагии аз ҳад зиёди РНК-ро талаб намекунад,балки реаксияхои ферментхоро бозмедорад.Талаботи боқимонда сахт аст.Даромад баромадро муайян мекунад;хар дафъа максади ба даст овардани РНК-и тозатарин аст, ин ба одамон ва маблаг сарф мешавад.
Ҷамъоварӣ/Нигоҳдории намунаҳо
Омилҳое, ки ба таназзул таъсир мерасонанд Пас аз тарк кардани намуна аз бадани зинда/ё муҳити аслии афзоиш, ферментҳои эндогенӣ дар намуна ба таназзули РНК шурӯъ мекунанд,ва суръати таназзул ба мундариҷаи ферментҳои эндогенӣ ва ҳарорат вобаста аст.Одатан, танҳо ду роҳи комилан манъ кардани фаъолияти ферментҳои эндогенӣ вуҷуд дорад: лизатро фавран илова кунед ва ҳамаҷониба ва зуд гомогенизатсия кунед;ба киемхои хурд бурида, фавран дар нитрогени моеъ ях мекунанд.Ҳарду равиш амалиёти зудро талаб мекунанд.Охирин барои ҳама намунаҳо мувофиқ аст, дар ҳоле ки аввалин танҳо барои бофтаҳои дорои миқдори ками ҳуҷайраҳо ва ферментҳои эндогенӣ мувофиқ аст ва гомогенизатсия осонтар аст.Махсусан, бофтаҳои растанӣ, ҷигар, тимус, гадуди зери меъда, испурч, майна, чарбу, бофтаи мушакҳо ва ғайраро пеш аз идома додан бо нитрогени моеъ яхбандӣ кардан беҳтар аст.
Фрагментатсия ва гомогенизатсияи намунаҳо
Омилҳое, ки ба таназзул ва ҳосил таъсир мерасонанд, тақсимоти намуна астбарои гомогенизатсияи ҳамаҷониба, ки барои пурра ва пурра баровардани РНК мебошад.Ҳуҷайраҳоро бидуни шикастан мустақиман гомогенизатсия кардан мумкин аст.Бофтаҳоро танҳо пас аз шикастан яксон кардан мумкин аст.Хамиртуруш ва бактерияҳоро пеш аз гомогенизатсия кардан лозим аст, ки бо ферментҳои мувофиқ шикаста шаванд.Бофтаҳои дорои таркиби ферментҳои эндогении камтар ва гомогенизатсияи осонтар метавонанд дар як вақт дар лизат тавассути гомогенизатор кӯфта ва гомогенизатсия карда шаванд;бофтаҳои растанӣ, ҷигар, тимус, гадуди зери меъда, испурч, майна, чарб, бофтаи мушакҳо ва дигар намунаҳо, Онҳо ё дар ферментҳои эндогенӣ зиёданд ё ба осонӣ гомогенизатсия намешаванд,бинобар ин вайрон кардани матоъ ва гомогенизатсия бояд алоҳида анҷом дода шавад.Усули боэътимодтарин ва сермахсули пора-поракунй бо нитрогени моеъ фрезер кардан ва боэътимодтарин усули гомогенизация истифода бурдани гомогенизатори электрики мебошад.Ёддошти махсус дар бораи фрезеркунӣ бо нитрогени моеъ: намуна набояд дар давоми тамоми раванди фреза об шавад, зеро ферментҳои эндогенӣ ҳангоми яхкунӣ эҳтимоли зиёд доранд.
Интихоби лизат
Таъсир ба роҳати амалиёт ва омилҳои боқимондаи ифлосҳои эндогенӣ Маҳлулҳои маъмулан истифодашавандаи лизис метавонанд фаъолияти RNase-ро тақрибан боздоранд.Аз ин рӯ, нуқтаи асосии интихоби ҳалли лизис ин аст, ки дар якҷоягӣ бо усули тозакунӣ баррасӣ карда шавад.Як истисно вуҷуд дорад:ба намунаҳои дорои миқдори зиёди ферментҳои эндогенӣ тавсия дода мешавад, ки лизати дорои фенолро барои баланд бардоштани қобилияти ғайрифаъол кардани ферментҳои эндогенӣ истифода баранд.
Интихоби усули тозакунӣ
Омилҳое, ки ба ифлосиҳои боқимондаи эндогенӣ, суръати истихроҷ таъсир мерасонанд. Барои намунаҳои тоза ба монанди ҳуҷайраҳо, бо қариб ҳама гуна усули тозакунӣ натиҷаҳои қаноатбахш ба даст овардан мумкин аст.Аммо барои бисёре аз намунаҳои дигар, махсусан онҳое, ки дорои сатҳи баланди наҷосат ба монанди растаниҳо, ҷигар, бактерияҳо ва ғайра мебошанд, интихоби усули мувофиқи поксозӣ муҳим аст.Усули тозакунии сутуни центрифуга суръати истихроҷи зуд дорад ва метавонад олудаҳоро, ки ба реаксияи минбаъдаи ферментативии РНК таъсир мерасонанд, самаранок нест кунад, аммо он гарон аст (Foregene метавонад маҷмӯаҳои камхарҷро пешниҳод кунад, тафсилоти бештарро клик кунед.Ин ҷо);бо истифода аз усулҳои сарфакорона ва классикии тозакунӣ, аз қабили боришот LiCl низ метавонад натиҷаҳои қаноатбахш ба даст орад, аммо вақти кор дароз аст..
"Се фан ва ҳашт таваҷҷӯҳ" барои истихроҷи РНК
Интизоми 1:Ба ифлосшавии ферментхои экзогенй хотима дода шавад.
Эзоҳ 1:Ниқоб ва дастпӯшакҳоро ба таври қатъӣ пӯшед.
Эзоҳ 2:Қубурҳои центрифуга, сарлавҳаҳои Маслиҳат, чӯбчаҳои пипетка, зарфҳои электрофорез ва курсиҳои таҷрибавӣ, ки дар таҷриба иштирок мекунанд, бояд бодиққат партофта шаванд.
Эзоҳ 3:Реагентҳо/маҳлулҳое, ки дар таҷриба иштирок мекунанд, махсусан об, бояд аз RNase озод бошанд.
Интизоми 2:Фаъолияти ферментҳои эндогениро бозмедорад
Эзоҳ 4:Усули мувофиқи гомогенизатсияро интихоб кунед.
Эзоҳ 5:Лизати мувофиқро интихоб кунед.
Эзоҳ 6:Миқдори ибтидоии намунаро назорат кунед.
Интизоми 3:Мақсади истихроҷи худро равшан кунед
Эзоҳ 7:Вақте ки ҳама гуна системаи лизат ба ҳадди ниҳоии ибтидоии намуна наздик мешавад, суръати муваффақияти истихроҷ якбора коҳиш меёбад.
Эзоҳ 8:Ягона меъёри иқтисодӣ барои истихроҷи бомуваффақияти РНК муваффақият дар таҷрибаҳои минбаъда аст, на ҳосил.
Top 10 Сарчашмаҳои ифлосшавии RNase
1. Ангуштҳо манбаи аввалини ферментҳои экзогенӣ мебошанд, бинобар ин дастпӯшакҳоро зуд-зуд пӯшидан ва иваз кардан лозим аст.Илова бар ин, ниқобҳо низ бояд пӯшида шаванд, зеро нафаскашӣ низ манбаи муҳими ферментҳо мебошад.Бартарии иловагии пӯшидани ниқоби дастпӯшак муҳофизати озмоишгар аст.
2. Маслиҳатҳои пипеткаҳо, найҳои центрифугаҳо, пипеткаҳо – RNase-ро танҳо бо стерилизатсия ғайрифаъол кардан мумкин нест, аз ин рӯ нӯги пипеткаҳо ва найҳои центрифуга бояд бо DEPC коркард карда шаванд, ҳатто агар онҳо ҳамчун коркарди DEPC қайд карда шаванд.Беҳтар аст, ки пипеткаи таъиноти махсусро истифода баред, пеш аз истифода онро бо пахтаи спирти 75% пок кунед, махсусан чӯбро;илова бар ин, боварӣ ҳосил кунед, ки сарро тоза кунед.
3. Об/буфер бояд аз ифлосшавии RNase холӣ бошад.
4. Ақаллан мизи санҷиширо бо куракҳои пахтаи спирти 75% пок кардан лозим аст.
5.Endogenous RNase Ҳама бофтаҳо дорои ферментҳои эндогенӣ мебошанд, аз ин рӯ зуд ях кардани бофтаҳо бо нитрогени моеъ роҳи беҳтарини коҳиш додани таназзул мебошад.Усули нигоҳдорӣ/майдакунии нитрогени моеъ воқеан нороҳат аст, аммо ин ягона роҳ барои бофтаҳои дорои сатҳи баланди ферментҳои эндогенӣ мебошад.
6. Намунаҳои РНК маҳсулоти истихроҷи РНК метавонанд дорои осори ифлосшавии RNase бошанд.
7. Истеҳсоли плазмид Истеҳсоли плазмид аксар вақт Rnase-ро барои таназзули РНК истифода мебарад ва Rnase боқимонда бояд бо Proteinase K ҳазм ва тавассути PCI истихроҷ карда шавад.
8. Нигоҳдории РНК Ҳатто агар он дар ҳарорати паст нигоҳ дошта шавад, миқдори микроэлементҳои RNase боиси таназзули РНК мегардад.Беҳтарин ҳалли нигоҳдории дарозмуддати РНК ин суспензияи намак/спирт мебошад, зеро спирт тамоми фаъолияти ферментативиро дар ҳарорати паст бозмедорад.
9. Вақте ки катионҳо (Ca, Mg) ин ионҳоро дар бар мегиранд, дар 80С дар 5 дақиқа гарм кардан боиси ҷудошавии РНК мегардад, бинобар ин, агар РНК гарм кардан лозим бошад, маҳлули консерватсионӣ бояд агенти хелаткунанда дошта бошад (1мМ цитрати натрий, pH 6,4).
10. Ферментҳое, ки дар таҷрибаҳои минбаъда истифода мешаванд, метавонанд бо RNase олуда шаванд.
10 Маслиҳат барои истихроҷи RNA
1: Фаъолияти RNase-ро зуд пешгирӣ кунед.Намунаҳо пас аз ҷамъоварӣ зуд ях мекунанд ва RNase бо амалиёти зуд ҳангоми лизис ғайрифаъол карда мешавад.
2: Усули мувофиқи истихроҷро барои бофтаи дорои миқдори зиёди рибозим интихоб кунед ва бофтаи чарбу беҳтар аст, ки усули дорои фенолро истифода барад.
3: Сифати пешгӯӣ Шимолро талаб мекунад, сохтмони китобхонаи cDNA якпорчагии баландро талаб мекунад ва RT-PCR ва RPA (таҳлили муҳофизати Рибонуклеаз) якпорчагии баландро талаб намекунад.RT-PCR тозагии баландро талаб мекунад (боқимондаҳои ингибиторҳои фермент).
4: Ҳомогенизатсияи ҳамаҷониба калиди баланд бардоштани ҳосилнокӣ ва коҳиш додани таназзул мебошад.
5: Санҷед, ки якпорчагии муайянкунии электрофорези РНК, 28S: 18S = 2: 1 аломати пурра аст, 1: 1 низ барои аксари таҷрибаҳо қобили қабул аст.
6: Хориҷ кардани ДНК барои RT-PCR, таҳлили массив беҳтар аст, ки Dnase I-ро барои хориҷ кардани ДНК истифода баред.
7: Кам кардани ифлосшавии ферментҳои экзогенӣ - ферментҳоро аз берун ворид кардан мумкин нест.
8: Ҳангоми консентратсияи кислотаи нуклеинӣ-консентратсияи паст, реагенти муштараки преципитация бояд илова карда шавад.Аммо барои пешгирии ко-преципитанти дорои ферментҳо ва ифлосшавии ДНК.
9: РНК-ро бодиққат ҳал кунед, агар лозим бошад, дар 65С барои 5 дақиқа гарм кунед.
усули нигоҳдории мувофиқ
Онро дар -20С дар муддати кутох ва дар -80С муддати дароз нигох доштан мумкин аст.Қадами аввал дар беҳтар кардани ҳосили РНК ин фаҳмидани он аст, ки мундариҷаи РНК дар намунаҳои гуногун хеле фарқ мекунад.Миқдори зиёд (2-4г/мг) ба монанди ҷигар, гадуди зери меъда, дил, фаровонии миёна (0,05-2г/мг) ба монанди майна, ҷанин, гурда, шуш, тимус, тухмдон, миқдори кам (<0,05уг/мг) мг) ба монанди масона, устухон, чарб.
1: Ҳуҷайраҳои лизис барои озод кардани RN - агар РНК бароварда нашавад, ҳосил кам мешавад.Гомогенизатсияи электрикӣ нисбат ба дигар усулҳои гомогенизатсия беҳтар кор мекунад, аммо инчунин метавонад бо усулҳои дигар, ба монанди мош кардани нитрогени моеъ, ҳозимаи ферментативӣ (Лизозим/Литиказа) якҷоя карда шавад.
2: Оптимизатсияи усули истихроҷ.Мушкилоти калонтарин бо усулҳои фенол асосёфта ин табақабандии нопурра ва талафоти қисман РНК мебошанд (супернатантро пурра нест кардан мумкин нест).Табақабандии нопурра аз сабаби миқдори зиёди кислотаи нуклеинӣ ва сафеда мебошад, ки онро тавассути зиёд кардани миқдори лизати истифодашуда ё кам кардани миқдори намуна ҳал кардан мумкин аст.Як қадами истихроҷи хлороформ ба бофтаи равған илова карда шуд.Талафоти РНК-ро тавассути обкашӣ ё хориҷ кардани қабати органикӣ ва пас аз центрифугакунӣ кам кардан мумкин аст.Мушкилоти калонтарин бо усулҳои центрифугакунии сутунҳо намунаи зиёдатӣ мебошад.
Маслиҳатҳои истихроҷи классикӣ
1. Тозакунии фенол: Ҳаҷми баробари 1:1 Фенол/Хлороформро илова кунед ва барои 1-2 дақиқа бошиддат омехта кунед.Бо суръати баланд барои 2 дақиқа центрифуга кунед.Бодиққат обро хориҷ кунед (80-90%).Ҳеҷ гоҳ ба қабати миёна наравед.Ҳаҷми баробари маҳлули реаксияро ба фенол/хлороформ илова кардан мумкин аст ва супернатант хориҷ карда мешавад.Ду супернатантро барои боришоти кислотаи нуклеинӣ барои беҳтар кардани ҳосил омехта кардан мумкин аст.Ҳангоми омехта кардан хеле нарм нашавед ва кӯшиш накунед, ки ҳама супернатантро тоза кунед.
2. Шустан бо этанол 70-80%: Ҳангоми шустан, кислотаи нуклеин бояд боздошта шавад, то намаки боқимонда шуста шавад.Дар айни замон, фавран пас аз рехтани этанол, бо суръати баланд чанд сония центрифуга карда, баъд бо пипетка этанол боқимондаро хориҷ кунед.Пас аз истодан дар ҳарорати хонагӣ барои 5-10 дақиқа об кунед.
11. Истехсоли ташкилотхои махсус
1. Бофтаи нахдор: Калиди истихроҷи РНК аз бофтаи нахдор ба монанди мушакҳои дил/скелетӣ комилан вайрон кардани бофта аст.Ин бофтаҳо зичии ҳуҷайраҳои кам доранд, бинобар ин миқдори РНК ба як воҳиди вазни бофта кам аст ва беҳтар аст, ки миқдори ибтидоиро ба қадри имкон истифода баред.Боварӣ ҳосил кунед, ки матоъро дар шароити яхкунӣ бодиққат майда кунед.
2. Бофтаҳои дорои протеин/равғани зиёд: майна/равғани растанӣ зиёд аст.Пас аз истихроҷи PCI, супернатант флокулаҳои сафед дорад.Молро аз нав бо хлороформ гирифтан лозим аст.
3. Бофтањои дорои кислотањои нуклеинї/рибозимњо: испурч/тимус дорои кислотаи баланди нуклеинї ва рибозим мебошад.Гирифтани матоъ дар шароити яхкунӣ ва пас аз гомогенизатсияи зуд метавонад рибозимҳоро ба таври муассир ғайрифаъол кунад.Аммо, агар лизат аз ҳад зиёд часпак бошад (аз сабаби миқдори зиёди кислотаи нуклеинӣ), истихроҷи PCI наметавонад ба таври муассир табақабандӣ кунад;илова кардани лизати бештар метавонад ин масъаларо ҳал кунад.Якчанд истихроҷи PCI метавонад ДНК-и боқимондаи бештарро хориҷ кунад.Агар дарҳол пас аз илова кардани спирти сафедпӯст пайдо шавад, ин ифлосшавии ДНК-ро нишон медиҳад.Боз истихроҷ бо PCI кислотаи пас аз обшавӣ метавонад ифлосшавии ДНК-ро хориҷ кунад.
4. Бофтаи растанӣ: Бофтаи растанӣ нисбат ба бофтаи ҳайвонот мураккабтар аст.Умуман, растаниҳо дар шароити нитрогени моеъ замин карда мешаванд, аз ин рӯ таназзули РНК аз ҷониби ферментҳои эндогенӣ маъмул аст.Агар мушкилоти таназзул ҳал карда нашавад, он бешубҳа аз ифлосиҳои дар намуна мавҷудбуда ба амал меояд.Наҷосатҳое, ки дар бисёр растаниҳо мавҷуданд, ба пасмондаҳо оварда мерасонанд ва сабаби боқимондаҳо аксар вақт дар он аст, ки ин наҷосат бо РНК баъзе шабоҳат доранд: шумо борид ва ман борид ва шумо адсорб кунед ва ман адсорб кунед.Ин хусусиятҳо муайян мекунанд, ки онҳо ингибиторҳои ферментҳои хеле қавӣ мебошанд.
Дар айни замон, реагентҳои истихроҷи РНК-и тиҷорӣ метавонанд тақрибан ба ҳама бофтаҳои ҳайвонот бо ислоҳоти хурд мутобиқ карда шаванд, аммо реагентҳои истихроҷи РНК-и тиҷоратӣ, ки метавонанд барои аксари бофтаҳои растанӣ мувофиқ бошанд, каманд.Хушбахтона, Foregene метавонад махсус таъмин намоядмаҷмӯаҳои истихроҷи РНК-и растанӣ, мо доремМаҷмӯаи изолятсияи RNA Total Plant, Маҷмӯаи изолятсияи умумии RNA Plant Plus.Охирин махсус барои растаниҳои дорои миқдори зиёди полисахаридҳо ва полифенолҳо пешбинӣ шудааст.Барои истихроҷи RNA, фикру мулоҳизаҳои корбарони лаборатория махсусан хуб аст.
12. Таъсири яхкунӣ ва обшавии намуна Намунаи яхкардашуда метавонад калонтар бошад ва онро пеш аз истифода барои истихроҷи РНК буридан лозим аст.Намунаҳо одатан ҳангоми буридан гудохта мешаванд (эҳтимолан қисман).Намунаҳои яхкардашуда метавонанд пеш аз истихроҷи РНК баркашида шаванд ва дар ин раванд обшавии ҳатман ба амал меояд.Баъзан обшавии намуна дар ҷараёни коркарди нитрогени моеъ низ ба амал меояд;ё намунаи яхкардашуда бевосита ба лизат бе резиши нитрогени моеъ илова карда мешавад ва обшавии ҳатман пеш аз гомогенизатсияи пурра ба амал меояд.Таҷрибаҳо нишон доданд, ки бофтаи яхкардашуда нисбат ба бофтаи тару тоза ҳангоми обшавӣ ба таназзули РНК бештар майл дорад.Сабаби эҳтимолӣ: Раванди яхкунӣ сохторҳои дохили ҳуҷайраро вайрон карда, тамоси мустақими ферментҳои эндогениро бо РНК осонтар мекунад.
13. Баҳодиҳии сифати РНК Одатан, электрофорез барои муайян кардани якпорчагии РНК ва A260/A280 барои доварӣ кардани покии РНК истифода мешавад.Дар назария, РНК-и солим таносуби 28S:18S = 2.7:1 дорад ва аксари маълумот таносуби 28S:18S = 2:1-ро таъкид мекунанд.Гап дар он аст, ки қариб ҳеҷ яке аз РНК-и аз намунаҳо ба ғайр аз ҳуҷайраҳо истихроҷшуда дар таносуби 2:1 нест (ин бо истифода аз Agilent Bioanalyzer гирифта шудааст).
Ба натиҷаҳои электрофорези РНК омилҳои зиёд таъсир мерасонанд, аз ҷумла сохтори дуюмдараҷа, шароити электрофорез, бори намуна, дараҷаи сершавӣ аз ҷониби EB ва ғайра. Барои ошкор кардани РНК электрофорези ватаниро истифода баред ва ДНК Маркерро ҳамчун назорат истифода баред.Агар 28S дар 2кб ва 18S дар 0.9кб равшан ва 28S: 18S > 1 бошад, якпорчагӣ метавонад ба талаботи аксари таҷрибаҳои минбаъда ҷавобгӯ бошад.
A260/A280 нишондиҳандаест, ки боиси нофаҳмиҳои зиёд шудааст.Пеш аз хама маънои аслии ин нишондодро барои кислотахои нуклеинй равшан кардан лозим аст: РНК-и холис, он A260/280 = такрибан 2,0.РНК-и пок "сабаб" ва A260/A280 = 2 "таъсир" аст.Ҳоло ҳама A260/A280-ро ҳамчун «сабаб» истифода бурда, фикр мекунанд, ки «агар A260/A280 = 2, пас РНК пок аст», ки табиатан боиси нофаҳмиҳо мегардад.
Агар шумо таваҷҷӯҳ дошта бошед, шумо метавонед ба намунаи RNA-и худ як реагенти каме, ки аксар вақт дар истихроҷ истифода мешавад, ба монанди фенол, гуанидин изотиоцианати, PEG ва ғайра илова кунед ва сипас таносуби A260/A280-ро чен кунед.Воқеият ин аст, ки бисёре аз реагентҳое, ки барои истихроҷи РНК истифода мешаванд, инчунин бисёр ифлосиҳо дар намуна тақрибан A260 ва A280-ро ҷаббида, ба A260/A280 таъсир мерасонанд.
Усули аз ҳама ибратбахш дар айни замон скан кардани намунаҳои РНК дар диапазони 200-300 нм мебошад.Каҷи РНК-и пок дорои хусусиятҳои зерин аст: каҷ ҳамвор аст, A230 ва A260 ду нуқтаи гардиш мебошанд, A300 ба 0 наздик аст, A260/A280 = тақрибан 2,0 ва A260/A230 = тақрибан 2,0.Агар маълумоти скан мавҷуд набошад, таносуби A260/A230 низ бояд муайян карда шавад, зеро ин таносуб ба интиқоли ҳама ифлосиҳо, ки ба реаксияи ферментативӣ таъсир мерасонанд, ҳассостар аст.Диапазони хаттии дастгоҳро ба назар гиред (0,1–0,5 барои A260).
Ду падидаи дигари муфид вуҷуд дорад: ҳангоми чен кардани A260/A280 дар об таносуб тақрибан 0,3 камтар мешавад;дар ҳоле ки таносуби дар 10 mM EDTA ченшуда тақрибан 0,2 зиёдтар аз он аст, ки дар 1 mM EDTA чен карда шудааст.
Маҳсулоти марбут:
Чин корхонаи умумии RNA изолятсияи маҷмӯаи истеҳсолкунанда ва таъминкунанда |Foregene (foreivd.com)
Силсилаи изолятсияи РНК - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Вақти фиристодан: июл-15-2022
