Маълум аст, ки дар догмаи марказӣ РНК миёнарави транскриптсионии байни ДНК ва ифодаи сафеда мебошад.Дар муқоиса бо ошкор кардани ДНК, ошкор кардани РНК метавонад ифодаи генҳоро дар организмҳо объективонатар инъикос кунад.Таҷрибаҳои марбут ба РНК иборатанд аз: qRT-PCR, RNA-Seq ва ошкоркунии генҳои синтез ва ғайра. Дар асоси хусусиятҳои худи РНК (ҳалқаи қанди РНК нисбат ба ҳалқаи қанди ДНК як гурӯҳи озоди бештари гидроксил дорад), дар якҷоягӣ бо шумораи зиёди RNases дар муҳити атроф, РНК нисбат ба ДНК ноустувортар аст ва таназзулаш осонтар аст.Партовҳо, партовҳо, агар сифати РНК хуб набошад, пас натиҷаҳои таҷрибавӣ бояд ғайриқаноатбахш бошанд, махсусан ҳамчун маълумоти нодуруст ё такроршавандагии суст зоҳир мешаванд.Аз ин рӯ, бояд ба коркарди РНК диққати бештар дода шавад ва пайванди назорати сифат низ барои таъмини дақиқ ва дурустии маълумоти таҷрибавии минбаъда муҳимтар аст.

Барои назорати сифати РНК, одатан усулҳои зерин маъмуланд:

• Спектрофотометрия
• электрофорези гели агароз
• Agilent Bioanalyzer
• PCR миқдории флюоресцентӣ дар вақти воқеӣ
• Усули рангкунии флуоресцентии Qubit

01 Спектрофотометрия

РНК пайвандҳои дукарата дорад ва қуллаи ҷаббида дар дарозии мавҷи 260 нм дорад.Тибқи қонуни Ламберт-Беер, мо метавонем консентратсияи РНК-ро аз қуллаи азхудкунӣ дар 260 нм ҳисоб кунем.Илова бар ин, мо метавонем тозагии РНК-ро аз рӯи таносуби қуллаҳои азхудкунии 260 нм, 280 нм ва 230 нм ҳисоб кунем.280нм ва 230нм мутаносибан қуллаҳои азхудкунии сафедаҳо ва молекулаҳои хурд мебошанд.Таносуби A260/A280 ва A260/A230-и тозагии RNA-и тахассусӣ бояд аз 2 зиёдтар бошад. Агар он аз 2 камтар бошад, ин маънои онро дорад, ки дар намунаи РНК олудашавии сафеда ё молекулаи хурд мавҷуд аст ва бояд дубора тоза карда шавад.Сарчашмаҳои ифлосшавӣ ба таҷрибаҳои поёноб таъсир мерасонанд, аз қабили ҷилавгирӣ аз самаранокии пурзӯркунии реаксияҳои ПТР, ки дар натиҷа натиҷаҳои миқдорӣ нодуруст мешаванд.Тозагии РНК ба натиҷаҳои минбаъда таъсири калон мерасонад, аз ин рӯ спектрофотометрия умуман як пайванди ҳатмӣ оид ба назорати сифат дар қадами аввал дар таҷрибаҳои кислотаи нуклеинӣ мебошад.

Расми 1. Спектри азхудкунии РНК/ДНК

02 Электрофорези агароз гел

Илова ба тозагӣ, якпорчагии РНК низ яке аз нишондиҳандаҳои муҳими доварӣ ба сифати РНК мебошад.Деградатсияи РНК ба шумораи зиёди порчаҳои кӯтоҳ дар намуна оварда мерасонад, аз ин рӯ шумораи порчаҳои РНК, ки метавонанд бо пайдарпаии истинод ба таври муассир ошкор ва фаро гирифта шаванд, кам карда мешавад.Якчандии РНК-ро тавассути электрофорези умумии РНК дар гели 1% агароз санҷидан мумкин аст.Ин усул метавонад худи гелро танзим кунад ё барои санҷиши якпорчагӣ Системаи омодашудаи E-Gel™ -ро истифода барад.Зиёда аз 80% РНК-и умумии РНК-и рибосомӣ мебошад, ки аксарияти онҳо аз 28S ва 18S rRNA (дар системаҳои ширхӯрон) иборатанд.РНК-и хушсифат ду бари равшани равшанро нишон медиҳад, ки онҳо мутаносибан 28S ва 18S барҳои дурахшон дар 5 Кб ва 2 Кб мебошанд ва таносуб ба 2: 1 наздик мешавад.Агар он дар ҳолати паҳншуда бошад, ин маънои онро дорад, ки намунаи РНК метавонад хароб шуда бошад ва тавсия дода мешавад, ки усули баъдтар тавсифшуда барои санҷиши минбаъдаи сифати РНК истифода шавад.

Расми 2. Муқоисаи РНК-и таназзулшуда (хати 2) ва солим (хати 3) дар электрофорези гели агароз

03 Bioanalyzer Agilent

Илова ба усули электрофорези агарози гели дар боло тавсифшуда, ки метавонад ба мо дар муайян кардани якпорчагии РНК ба осонӣ ва зуд кӯмак кунад, мо инчунин метавонем биоанализери Agilent-ро барои муайян кардани якпорчагии РНК истифода барем.Он маҷмӯи микрофлюидҳо, электрофорези капиллярӣ ва флуоресцентро барои арзёбии консентратсияи РНК ва якпорчагӣ истифода мебарад.Бо истифода аз алгоритми дарунсохт барои таҳлили профили намунаи РНК, биоанализери Agilent метавонад арзиши якпорчагии РНК-ро ҳисоб кунад, рақами якпорчагии РНК (минбаъд RIN) [1].Чӣ қадаре ки арзиши RIN калон бошад, ҳамон қадар якпорчагии РНК баландтар аст (1 хеле вайрон шудааст, 10 пурратар аст).Баъзе таҷрибаҳо бо РНК тавсия медиҳанд, ки RIN ҳамчун параметр барои арзёбии сифат истифода шавад.Гирифтани таҷрибаҳои пайдарпайии баландсуръат (минбаъд NGS) ҳамчун намуна, роҳнамоии Oncomine™ Repertoire Immune Human Human, ки барои муайян кардани ретсепторҳои антигени ҳуҷайраҳои B ва T дар силсилаи панели Oncomine-и Thermo Fisher истифода мешавад, пешниҳод мекунад, ки намунаҳои дорои арзишҳои RIN аз 4,5 зиёдтар хонда шаванд ва ченакҳои бештар самаранок бошанд (3).Барои панелҳои гуногун диапазонҳои тавсияшаванда мавҷуданд ва аксар вақт RIN баландтар метавонад маълумоти муассиртар оварад.

Тасвири 3, дар таҷрибаҳои Repertoire Immune Human Oncomine, намунаҳои дорои RIN аз 4 зиёдтар метавонанд хонишҳои муассиртар ва клонҳои ҳуҷайраҳои Т-ро муайян кунанд.【2】

Аммо, арзиши RIN низ баъзе маҳдудиятҳо дорад.Гарчанде ки RIN бо сифати маълумоти таҷрибавии NGS таносуби баланд дорад, он барои намунаҳои FFPE мувофиқ нест.Намунаҳои FFPE муддати тӯлонӣ бо усули кимиёвӣ коркард шудаанд ва РНК-и истихроҷшуда одатан арзиши нисбатан пасти RIN дорад.Аммо ин маънои онро надорад, ки маълумоти самарабахши таҷриба бояд ғайриқаноатбахш бошад.Барои дуруст арзёбӣ кардани сифати намунаҳои FFPE, мо бояд ченакҳоро ғайр аз RIN истифода барем.Илова ба RIN, биоанализери Agilent инчунин метавонад арзиши DV200-ро ҳамчун параметри арзёбии сифати РНК ҳисоб кунад.DV200 параметрест, ки таносуби порчаҳои аз 200 bp калонтарро дар намунаи РНК ҳисоб мекунад.DV200 нишондиҳандаи беҳтари сифати намунаи FFPE нисбат ба RIN мебошад.Барои РНК, ки аз ҷониби FFPE истихроҷ шудааст, он бо шумораи генҳое, ки ба таври муассир ошкор карда мешаванд ва гуногунии генҳо таносуби хеле баланд дорад [3].Гарчанде ки DV200 метавонад норасоиҳоро дар муайянкунии сифати FFPE ҷуброн кунад, биоанализери Agilent то ҳол мушкилоти сифатро дар намунаҳои РНК, аз ҷумла мавҷудияти ингибиторҳо дар намунаҳо ҳамаҷониба таҳлил карда наметавонад.Худи ингибиторҳо метавонанд ба самаранокии тақвияти таҷрибаҳои поёноб таъсир расонанд ва миқдори маълумоти муфидро кам кунанд.Барои фаҳмидани он ки оё дар намуна ингибитор вуҷуд дорад, мо метавонем усули флюоресцентии миқдорӣ ПТР-ро дар вақти воқеӣ қабул кунем, ки дар оянда тавсиф карда мешавад.

04 PCR миқдории флюоресцентӣ дар вақти воқеӣ

Усули воқеии флюоресцентии PCR метавонад на танҳо ингибиторҳоро дар намуна муайян кунад, балки сифати РНК-ро дар намунаи FFPE дақиқ инъикос кунад.Дар муқоиса бо анализаторҳои биологии Agilent, асбобҳои миқдорӣ дар вақти воқеӣ аз сабаби татбиқи васеътари онҳо дар лабораторияҳои асосии биологӣ маъмултаранд.Барои санҷидани сифати намунаҳои РНК, мо танҳо лозим аст, ки зондҳои ибтидоӣ барои генҳои истинодҳои дохилӣ, ба мисли GUSB (Кат № Hs00939627) харидорӣ ё омода кунем.Бо истифода аз ин маҷмӯи праймерҳо, зондҳо ва стандартҳо (РНК-и консентратсияи маълум) барои гузаронидани таҷрибаҳои мутлақи миқдорӣ, консентратсияи самарабахши порчаи РНК-ро метавон ҳамчун стандарти арзёбии сифати РНК (Миқдори Функсияи РНК (FRQ) барои кӯтоҳ) ҳисоб кард.Дар санҷиши NGS, мо дарёфтем, ки FRQ-и намунаҳои RNA бо ҳаҷми муассири маълумот робитаи хеле баланд дорад.Барои ҳама намунаҳое, ки аз 0.2ng/uL FRQ зиёдтаранд, ҳадди аққал 70% хондан метавонанд пайдарпаии истинодро самаранок фаро гиранд (Расми 4).

Расми 4, арзиши FRQ, ки бо усули миқдорӣ флуоресцентӣ муайян карда шудааст, бо маълумоти муассир дар таҷрибаи NGS таносуби хеле баланд (R2>0,9) дорад.Хати сурх арзиши FRQ ба 0,2 нг/уЛ баробар аст (log10 = -0,7).【4】

Илова бар он, ки ба намунаҳои FFPE татбиқ карда мешавад, усули миқдорӣ дар вақти воқеӣ инчунин метавонад ингибиторҳоро дар намунаҳо назорат кунад.Мо метавонем намунаеро, ки ба системаи реаксия бо назорати дохилии мусбӣ (IPC) ва таҳлили он ошкор карда мешавад, илова кунем ва сипас барои ба даст овардани арзиши Ct миқдори флуоресцентро анҷом диҳем.Агар арзиши Ct дар реаксияи бенамуна аз арзиши Ct ақиб монад, ин нишон медиҳад, ки ингибитор дар намуна мавҷуд аст ва самаранокии амплификацияро дар реаксия бозмедорад.

05 Усули рангкунии флуоресцентии Qubit

Qubit Fluormeter як дастгоҳи хурдтарини маъмултарин барои консентратсияи кислотаи нуклеинӣ ва муайян кардани тозагӣ мебошад, ки кор кардан осон аст ва тақрибан дар ҳама лабораторияҳои биологияи молекулавӣ мавҷуд аст.Он консентратсияи кислотаи нуклеинро бо роҳи муайянкунӣ ва рангҳои флуоресцентии ба кислотаи нуклеин пайвасткунанда (реагенти муайянкунии Qubit) дақиқ ҳисоб мекунад.Qubit ҳассосият ва хосияти баланд дорад ва метавонад РНК-ро то консентратсияи pg/µL дақиқ муайян кунад.Илова ба қобилияти маъруфи дақиқ муайян кардани консентратсияи кислотаи нуклеинӣ, модели нави Thermo Fisher Qubit 4.0 инчунин метавонад якпорчагии РНК-ро муайян кунад.Системаи муайянкунии RNA Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) якпорчагии РНК-ро тавассути ошкор кардани ду рангҳои мушаххаси флуоресцентӣ дар як вақт муайян мекунад.Ин ду рангҳои флуоресцентӣ метавонанд мутаносибан ба порчаҳои калон ва порчаҳои хурди РНК пайваст шаванд.Ин ду рангҳои флюоресцентӣ таносуби порчаҳои калони РНК-ро дар намуна нишон медиҳанд ва аз ин ҳисоб арзиши IQ (Беайбӣ ва сифат), ки сифати РНК-ро ифода мекунад, ҳисоб кардан мумкин аст.Арзиши IQ ҳам ба намунаҳои FFPE ва ҳам ғайри FFPE дахл дорад ва ба сифати пайдарпайии минбаъда таъсири бузург дорад.Бо назардошти таҷрибаҳои NGS, дар таҷрибаҳои санҷишии RNA-Seq, ки дар платформаи Ion torrent™ анҷом дода шудааст, аксари намунаҳое, ки арзишҳои IQ аз 4 зиёданд, ҳадди аққал 50% хониши муассир доштанд (Расми 5).Дар муқоиса бо усулҳои дар боло зикршуда, Qubit IQ Assay кор кардан на танҳо қулайтар аст ва вақти камтарро (дар давоми панҷ дақиқа) мегирад, балки байни арзиши параметри ченшудаи IQ ва сифати маълумоти таҷрибаҳои поёноб низ таносуби бузург дорад.

Тасвири 5, байни арзиши Qubit RNA IQ ва хондани хариташудаи RNA-Seq таносуби бузург вуҷуд дорад.【5】

Тавассути муқаддимаи дар боло овардашуда, ман боварӣ дорам, ки ҳама дар бораи усулҳои гуногуни назорати сифати RNA фаҳмиши кофӣ доранд.Дар амал, шумо метавонед интихоб кунедусули мувофиқ аз рӯи намуди намуна ва асбобҳои мавҷуда.Танҳо тавассути назорати хуби сифати РНК мо метавонем аз нокомии таҷрибаҳои минбаъда, ки дар натиҷаи сифати пасти намуна ба вуҷуд омадаанд, канорагирӣ кунем ва бо ин васила вақт, энергия ва хароҷоти гаронбаҳоро сарфа кунем.

Маҳсулоти истинод:

Маҷмӯаи изолятсияи умумии RNA Animal

Маҷмӯаи изолятсияи умумии RNA ҳуҷайра

маълумотномаҳо

【1】Шредер, А., Мюллер, О., Стокер, С. ва дигарон.RIN: рақами якпорчагии РНК барои таъини арзишҳои якпорчагӣ ба андозагирии РНК.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Дастури корбарии Oncomine иммунии инсон (Нашр. № MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Леа Си Вехмас, Чарлз Е Вуд, Брайан Н Чорли, Кэрол Л Яук, Гейл М Нелсон, Сюзан Д Ҳестер, Метрикҳои мукаммали сифат барои арзёбии РНК, ки аз бойгонии намунаҳои бофтаи формалини собит бо парафини дарунсохташуда, Илмҳои токсикологӣ, Ҷилди 120, Август 7–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/