Маҷмӯаи муайянкунии кислотаи нуклеинӣ Escherichia coli O157: H7 (Усули зондҳои флуоресцентии PCR)
Тавсифи маҷмӯа:
Cat.No.FP102
Он барои зуд ошкор ва скрининги E. coli O157:H7 дар ғизо, ғизо, намунаҳои об ва намунаҳои муҳити зист истифода мешавад.
Тавсифҳо
Он барои зуд ошкор ва скрининги E. coli O157:H7 дар ғизо, ғизо, намунаҳои об ва намунаҳои муҳити зист истифода мешавад.
[Принсипи санҷиш]Тибқи принсипи технологияи флюоресцентии PCR, праймерҳои мушаххас ва зондҳои тақман барои гени мушаххаси Escherichia coli O157: H7 тарҳрезӣ шудаанд ва тавассути асбоби флуоресцентии PCR муайян карда мешаванд, то ошкоркунии Escherichia coli O157: H7 Муайянкунии сифатии ДНК.
Мундариҷаи маҷмӯа
Эзоҳ: Санҷиши канали ROX дохил карда нашудааст.
| Cмухолифон | Мушаххасот | Qякдилӣ |
| Буфер А | Туб | 1 |
| Буфер Б | Туб | 1 |
| Назорати мусбӣ | Туб | 1 |
| Назорати манфӣ | Туб | 1 |
Истифодаи пешбинишуда
Барои он истифода мешавад ошкор ва скрининги босуръати E. coli O157:H7 дар ғизо, ғизо, намунаҳои об ва намунаҳои муҳити зист.
Шароити нигоҳдорӣ ва мӯҳлати истифода
Дар -20 ℃ дар торикӣ нигоҳ доред ва аз яхкунӣ ва обшавии такрорӣ худдорӣ кунед.
Мӯҳлати эътибор 12 астмоҳ ва санаи истеҳсол дар бастаи берунӣ нишон дода шудааст.
Асбобхо ва масолех
Асбоби флюоресцентии PCR-и миқдорӣ, таппончаи пипетка ва маслиҳатҳои мувофиқ, ларзиши гирдоб, центрифугаи хурд.
Истифода
1. Коркарди намуна
1.1 Навъи намуна: Ин маҷмӯа барои ғизо, ғизо, намунаҳои об ва дигар намунаҳое мувофиқ аст, ки гумонбаршуда бо Escherichia coli O157:H7 олуда шудаанд.Барои маҳсулоти гӯшти амиқи коркардшуда, нӯшокиҳо ва дигар моддаҳои дорои пигментҳо, онҳо бояд шуста шаванд, то ба ҷамъоварии сигналҳои флуоресцентӣ таъсир нарасонанд.
1.2 Коркарди намуна: Ба "GB 4789.10-2016 Стандарти миллии бехатарии озуқаворӣ Экспертизаи микробиологии Escherichia coli O157: Санҷиши H7" барои тайёр кардани намуна, фарҳанги ғанисозӣ ва ҷудокунии Escherichia coli O157: H7 нигаред.
- Nистихроҷи кислотаи ucleic
20 мл маҳлули ғанигардониро дар найчаи центрифугаи 1,5 мл гиред, 200 мкл лизати микробӣ илова кунед (маҷмӯаи иловагӣ лозим аст), 30 сония гирдоб кунед, центрифугаро кӯтоҳ кунед ва як тараф гузоред.
Эзоҳ: истихроҷи кислотаи нуклеин аз лизат бояд дар давоми 10 дақиқа анҷом дода шавад ва онро барои муддати тӯлонӣ нигоҳ доштан мумкин нест.
3. Амплификатсияи кислотаи нуклеинӣ
3.1 Асбоби флюоресцентии PCR-ро барои истифода фаъол созед.
Буфери А ва буфери В аз маҷмӯа, онҳоро бодиққат об кунед ва ба муддати кӯтоҳ центрифуга кунед.Ба ҳар як найчаи реаксияи PCR 18 мкл буфери А ва 2 мкл буфери В илова кунед.Сипас 5 мл ҳар як аз назорати манфӣ, кислотаи нуклеини истихроҷшуда ва назорати мусбӣ ба найҳои реаксияи ПТР илова кунед, қубурҳоро пӯшед ва ба муддати кӯтоҳ центрифуга кунед.
3.3 Туби реаксияи ПТР-ро ба мошини флуоресцентии ПЗР интиқол диҳед ва барои иҷрои таҷрибаҳои пурқувваткунӣ аз расмиёти зерин истифода баред: 25 мл барои системаи реаксия, ҷамъ кардани сигналҳои флуоресцентӣ дар 60°C барои ҳар як давра ва FAM барои канали муайянкунӣ интихоб кунед.
| Қадам | Барнома | Шумораи давраҳо |
| 1 | 37℃ 5дақ | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 дақиқа | 1 |
| 3 | 95°С 15с | 4 0 |
| 60 ℃ 30 сония (ҷамъ кардани флуоресцент) |
Дастурҳо барои таҳлили мушкилот
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Ягон РНК гирифта намешавад ё ҳосили кислотаи нуклеин паст аст
Одатан омилҳои зиёде мавҷуданд, ки ба самаранокии барқарорсозӣ таъсир мерасонанд, ба монанди: мундариҷаи намунаи РНК, усули кор, ҳаҷми элюсия ва ғайра.
Таҳлили сабабҳои умумӣ:
1.Ваммом ях ё центрифуга дар ҳарорати паст (4 ° C) ҳангоми кор.
Пешниҳод: Ҳарорати хонагӣ (15-25 ° C) амалиёт, ҳеҷ гоҳ ваннаи ях ва центрифуга ҳарорати паст.
2. Нигоҳдории нодурусти намуна ё нигоҳдории намуна барои хеле дароз.
Пешниҳод: Намунаҳоро дар -80 ° C нигоҳ доред ё дар нитрогени моеъ ях кунед ва аз истифодаи такрории яхкунӣ худдорӣ кунед;кӯшиш кунед, ки намунаҳои навҷамъовардашударо барои истихроҷи РНК истифода баред.
3.Лизиси нокифояи намуна
Тавсия: Лутфан боварӣ ҳосил кунед, ки намуна ва маҳлули корӣ (Акриламиди хатӣ) бодиққат омехта карда шуда, барои 10 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ (15-25 ° C) инкубатсия карда шудаанд.
4. Элюент нодуруст илова карда шудааст
Тавсия: Боварӣ ҳосил кунед, ки RNase-Free ddH2O ба мобайни мембранаи сутуни тозакунӣ илова карда шудааст.
5.Ҳаҷми номатлуби этаноли беоб дар буфери viRW2
Пешниҳод: Лутфан дастурҳоро иҷро кунед, ба буфери viRW2 ҳаҷми дурусти этаноли беобро илова кунед ва пеш аз истифодаи маҷмӯа онҳоро хуб омехта кунед.
6.Истифодаи нодурусти намуна.
Пешниҳод: 200 мкл намуна барои 500 мкл буфери viRL.Ҳаҷми аз ҳад зиёди намуна боиси коҳиши суръати истихроҷи РНК мегардад.
7. Ҳаҷми элюсияи номатлуб ё элюсияи нопурра.
Пешниҳод: Ҳаҷми элюенти сутуни тозакунӣ 30-50μl аст;агар таъсири элюционӣ қаноатбахш набошад, тавсия дода мешавад, ки RNase-Free ddH-и қаблан гармшуда илова карда шавад.2О ва дароз кардани вақти ҷойгиркунӣ дар ҳарорати хонагӣ, ба монанди 5-10 дақиқа
8.Сутуни поксозӣ пас аз шустан дар буфери viRW2 пасмондаҳои этанол дорад.
Пешниҳод: Агар этанол пас аз шустан дар буфери viRW2 ва центрифугаи холӣ дар тӯли 2 дақиқа боқӣ монад, сутуни тозакуниро пас аз центрифугаи холӣ дар найчаи холӣ дар ҳарорати хонагӣ барои 5 дақиқа гузоштан мумкин аст, то этанол боқимонда пурра хориҷ карда шавад.
Деградатсияи молекулаҳои тозашудаи РНК
Сифати РНК-и тозашуда бо омилҳо ба монанди нигоҳдории намуна, ифлосшавии RNase ва амалиёт алоқаманд аст.
Таҳлили сабабҳои умумӣ:
1. Намунаҳои ҷамъшуда сари вақт захира карда нашуданд.
Пешниҳод: Агар намуна пас аз ҷамъоварӣ сари вақт истифода нашавад, лутфан онро дар -80 ℃ ё нитрогени моеъ фавран нигоҳ доред.Барои истихроҷи молекулаҳои РНК, кӯшиш кунед, ки то ҳадди имкон намунаҳои тоза ҷамъшударо истифода баред.
2. Намунаҳои ҷамъовардашуда такроран яхкунӣ ва обшавӣ буданд.
Пешниҳод: Ҳангоми ҷамъоварӣ ва нигоҳдории намуна аз яхкунӣ ва обшавии такрорӣ (на бештар аз як маротиба) худдорӣ намоед, вагарна ҳосили кислотаи нуклеин кам мешавад.
3.RNase дар ҳуҷраи ҷарроҳӣ ҷорӣ карда шуд ё дастпӯшакҳои якдафъаина, ниқобҳо ва ғ.
Пешниҳод: Таҷрибаи истихроҷи молекулаҳои РНК беҳтарин дар як ҳуҷраи алоҳидаи амалиёти РНК анҷом дода мешавад ва мизи таҷрибавӣ пеш аз таҷриба тоза карда мешавад.Ҳангоми таҷриба дастпӯшакҳо ва ниқобҳои якдафъаина пӯшед, то аз таназзули РНК дар натиҷаи воридкунии RNase пешгирӣ карда шавад.
4.Дар реагент ҳангоми истифода бо RNase олуда шудааст.
Пешниҳод: Барои таҷрибаҳои алоқаманд бо маҷмӯаи нави изолятсияи вирусии РНК иваз кунед.
5.Ифлосшавии RNase аз найҳои сентрифуга, маслиҳатҳои пипеткаҳо ва ғ. Пешниҳод: Боварӣ ҳосил кунед, ки найҳои сентрифуга, нӯги пипеткаҳо ва пипеткаҳо ҳама аз RNase озоданд.
Молекулаҳои РНК тозашуда ба таҷрибаҳои поёноб таъсир расониданд
Молекулаҳои РНК, ки аз ҷониби сутуни тозакунӣ тоза карда шудаанд, ба таҷрибаҳои поёноб таъсир мерасонанд, агар ионҳои намак ё сафедаҳои аз ҳад зиёд мавҷуд бошанд, ба монанди: транскрипсияи баръакс, Northern Blot ва ғайра.
1.Дар молекулаҳои элюташудаи РНК ионҳои намаки боқимонда мавҷуданд.
Тавсия: Боварӣ ҳосил кунед, ки ҳаҷми дурусти этаноли беоб ба буфери viRW2 илова карда шудааст ва сутуни тозакуниро ду маротиба мувофиқи суръати дурусти центрифугакунӣ дар дастури истифода бишӯед;Сипас центрифугаро анҷом диҳед, то ифлосшавии ионҳои намакро то ҳадди аксар тоза кунед
2.Дар молекулаҳои элюташудаи РНК этанол боқимонда мавҷуд аст
Пешниҳод: Пас аз тасдиқи он, ки сутунҳои тозакунӣ бо буфери viRW2 шуста шудаанд, центрифугаи холии қубурро мувофиқи суръати марказгурез дар дастури истифода иҷро кунед.Агар то ҳол этанол боқӣ монда бошад, пас аз центрифугаи найчаи холӣ онро дар ҳарорати хонагӣ барои 5 дақиқа гузоштан мумкин аст, то этанол боқимонда то ҳадди аксар хориҷ карда шавад.
Дастурҳои дастурӣ:
Дастури дастурии маҷмӯаи изолятсияи вирусии RNA
