1. Фаҳмиши ибтидоӣ

Дар ин марҳила, мо бояд баъзе мафҳумҳо ва истилоҳотро дарк кунем, то дар назди калонсолони худ хато накунем, масалан:

Савол: Фарқи байни RT-PCR, qPCR, PCR дар вақти воқеӣ ва RT-PCR дар вақти воқеӣ чӣ гуна аст?

(ПТР транскрипсияи баръакс, RT-PCR), ки як варианти васеъ истифодашавандаи реаксияи занҷири полимеразӣ (PCR) мебошад.Дар RT-PCR, риштаи РНК баръакс ба ДНК-и комплементарӣ транскрипт карда мешавад, ки баъдан ҳамчун қолаб барои амплификацияи ДНК тавассути ПТР истифода мешавад.
Дар вақти воқеӣ-PCR ва qPCR

PCR, PCR-и вақти воқеӣ одатан ҳамчун qPCR (миқдори PCR вақти воқеӣ) ихтисор карда мешавад..

Ва дар вақти воқеӣ RT-PCR (RT-qPCR), Ин як транскрипсияи баръакси PCR дар якҷоягӣ бо технологияи миқдории флуоресцентӣ мебошад: аввал cDNA (RT) аз транскрипсияи баръакси РНК гиред ва сипас барои таҳлили миқдорӣ (qPCR) PCR-ро дар вақти воқеӣ истифода баред.Таҳлили миқдорӣ, ба монанди ошкор кардани вируси гепатити В HBV.

Савол: Пас аз хондани миқдори зиёди PCR-и флюоресцентӣ, чаро порчаи пурқувватшуда бояд дар доираи 80-300bp назорат карда шавад?

ҶавобПорчаи маҳсулот хеле кӯтоҳ аст, ки аз ибтидо-димер фарқ кардан мумкин нест.

Масалан, вақте ки шумо дар як синф чанд нафарро ҳисоб мекунед, шумо бояд танҳо чанд даҳонро ҳисоб кунед.Ҳамин чиз дуруст аст, вақте ки шумо генҳоро ошкор мекунед, ба шумо танҳо лозим аст, ки пайдарпайии муайяни генро муайян кунед, то тамоми пайдарпайро нишон диҳед.Агар шумо хоҳед, ки одамонро ҳисоб кунед, шумо бояд даҳон ва бинӣ, гӯш ва айнакро ҳисоб кунед ва хато кардан осон аст.

Савол: Дарозии оптималии тарҳи праймери qPCR чанд аст?

Ҷавоб: Умуман, дарозии ибтидоӣ тақрибан 20-24bp аст, ки беҳтар аст.Пас аз таҷрибаҳои зиёд исбот карда шуд, ки 60°C арзиши беҳтари TM аст.Агар ҳарорати гармкунӣ хеле паст бошад, он ба осонӣ ба амплификацияи ғайримуқаррарӣ оварда мерасонад.

Савол: Усули рангкунӣ аз усули зонд чӣ фарқ дорад?

Ҷавоб: Усули рангкунӣАз ин рӯ, дар оғози реаксияи PCR, мошин сигнали флуоресцентиро муайян карда наметавонад.Усули рангкунӣ асосан дар тадқиқоти илмӣ истифода мешавад.
PS: Ҳангоми гузаронидани таҷриба эҳтиёт бошед, ранг бояд бо ДНК-и инсон омехта шавад, эҳтиёт шавед, ки онро ба шахси флуоресцентӣ табдил диҳед.

Усули ранг (аз чап) Усули зонд (аз рост)
PS: Ҳангоми гузаронидани таҷриба эҳтиёт бошед, ранг бояд бо ДНК-и инсон омехта шавад, эҳтиёт шавед, ки онро ба шахси флуоресцентӣ табдил диҳед.

Усули санҷишЗондҳои Такман аз ҳама маъмултарин зондҳои гидролизӣ мебошанд.Дар 5′ охири зонд як гурӯҳи флуоресцентӣ мавҷуд аст, одатан FAM ва худи зонд пайдарпаии иловагии гени мавриди ҳадаф аст.Дар охири 3' гурӯҳи хомӯшкунандаи флуоресцент мавҷуд аст.Мувофиқи принсипи интиқоли энергияи резонанси флуоресцентӣ (Förster resonance Energy Transfer, FRET), вақте ки гурӯҳи флуорессенти хабарнигор (молекулаи флуоресценти донор) ва гурӯҳи хомӯшкунандаи флуоресцентӣ (молекулаи флуоресценти қабулкунанда) ҳаяҷон мекунанд, Вақте ки спектрҳо ба ҳам мепайванданд ва масофаи хеле наздик (7-10 м) метавонад флюоресценти флюоресцентии резонансиро дар дохили флюоресцентҳо), молекулаи аксепторӣ, дар ҳоле ки автофлуоресцентсия заиф мешавад.Аз ин рӯ, дар оғози реаксияи PCR, вақте ки зонд дар система озод ва солим аст, гурӯҳи флуоресценти хабарнигор флуорессенсия намебарорад.Ҳангоми коркард, праймер ва зонд ба қолаб мепайвандад.Дар марҳилаи васеъшавӣ, полимераз пайваста занҷирҳои навро синтез мекунад.ДНК полимераза дорои фаъолияти 5'-3' экзонуклеаза мебошад.Ҳангоми расидан ба зонд, полимеразаи ДНК зондро аз қолаб гидролиз мекунад, гурӯҳи флуоресценти хабарнигорро аз гурӯҳи флуоресценти хомӯшкунанда ҷудо мекунад ва сигнали флуоресцентиро мебарорад.Азбаски байни зонд ва қолаб робитаи як ба як вуҷуд дорад, усули зонд аз ҷиҳати дақиқӣ ва ҳассосияти санҷиш аз усули рангкунӣ бартарӣ дорад.Усули зонд асосан дар ташхис истифода мешавад.

Савол: Миқдори мутлақ чист?Миқдори нисбӣ чист?

Ҷавоб

Савол: Оё миқдори истихроҷи РНК, самаранокии транскрипсияи баръакс ва самаранокии амплификация ба натиҷаҳои таҷриба таъсир мерасонад?
Савол: Оё нигоҳдории намуна, реагентҳои экстраксия, реагентҳои транскрипсияи баръакс ва масолеҳи интиқоли нур ба натиҷаҳои таҷриба таъсир мерасонад?
Савол: Кадом усул метавонад маълумоти таҷрибавиро ислоҳ кунад?

Вобаста ба ин масъалаҳо, мо онҳоро дар қисматҳои пешрафта ва пешрафтаи зер муфассал шарҳ медиҳем.
2. Дониши мукаммал

Агар стандарти умумӣ барои чен кардани озмоиши миқдорӣ PCR флуоресцентӣ вуҷуд надошта бошад, натиҷаҳо метавонанд ба таври васеъ фарқ кунанд.Шумо ҳеҷ кас намедонад, ки кадомаш дуруст асту кадомаш нодуруст.

Оё ин маънои онро дорад, ки PCR-и миқдории флюоресцентӣ технологияи фиреб ё технологияи беэътимод аст?Не, ин аз он сабаб аст, ки PCR-и миқдории флюоресцентӣ ҳассостар ва дақиқтар аст ва амалиёти каме нодуруст натиҷаҳои комилан муқобилро медиҳад..Муаллифи макола аз тарафи рецензйрон борхо шиканча шуда метавонад.Дар баробари ин, аз натиљањои гуногуни таљрибавї интихоб кардан ба муќризони маљалла низ душвор аст.

Дар маҷмӯъ, ба набудани консенсус дар таҷрибаҳои PCR дар вақти воқеӣ ишора мекунад.Бо ин мақсад олимони калони соҳа ба таҳияи стандартҳо,талаб мекунад, ки саҳмгузорон баъзе тафсилоти зарурии таҷрибавӣ ва коркарди маълумотро (аз ҷумла маълумоти заруриро) дар мақола пешниҳод кунанд, то ба ин стандартҳо ҷавобгӯ бошанд.

Тафсиркунандагон метавонанд бо хондани ин тафсилот ба сифати озмоиш доварӣ кунанд;хонандагони оянда низ метавонанд инро барои такрор кардани таҷриба ё такмил додани таҷриба истифода баранд.Он гоҳ натиҷаҳои таҷрибавӣ, ки бо ин роҳ ба даст оварда шудаанд, пур аз иттилоот, сифати баланд ва қобили истифода мебошанд.

MIBBI (Маълумоти ҳадди ақал барои таҳқиқоти биологӣ ва биотиббӣ -http://www.mibbi.org) ба вучуд омад.MIBBI лоиҳаест, ки стандартҳоро барои таҷрибаҳо таъмин мекунад.Он дар табиат нашр шудааст.Ин лоиҳа ба таҷрибаҳои гуногуни биологӣ, аз ҷумла биологияи ҳуҷайра, Microarray, qPCR, ки мо ҳоло муҳокима хоҳем кард ва ғайра нигаронида шудааст ва ҳар як намуди таҷрибаро ҳангоми пешниҳоди дастнависҳо пешбинӣ мекунад.Ин маълумот бояд ҳамеша пешниҳод карда шавад.

Дар лоиҳаи MIBBI ду мақолаи марбут ба PCR-и флюоресцентӣ мавҷуданд, яъне:
·RDML (Забони Real-Time PCR Data Markup Language) – забони сохторӣ ва дастури гузоришдиҳӣ барои маълумоти миқдорӣ дар вақти воқеӣ;
·MIQE (Minimum Information for Publish of Quantitative Experiments PCR) – маълумоти ҳадди ақал барои нашри мақолаҳо дар бораи таҷрибаҳои миқдорӣ дар вақти воқеӣ.
Аввалан, биёед дар бораи RDML, мушаххасоти истилоҳот сӯҳбат кунем.

Агар барои ҳама чиз таърифи стандартӣ мавҷуд набошад, идома додани баҳс ғайриимкон аст, бинобар ин шарҳи истилоҳот дар имтиҳон хеле муҳим аст.
Истилоҳоте, ки дар таҷрибаи флюоресцентии миқдорӣ истифода мешавад, мундариҷаи зеринро дар бар мегирад.QIAGEN барои мо хулосаи беҳтаринро дод.Ҳама чизҳои зерин хушкандмол .

Хатти амплификация
Каҷи пурқувват ба каҷе, ки дар ҷараёни PCR сохта шудааст, бо рақами давра ҳамчун абсцисса ва шиддатнокии флуорессент дар вақти воқеӣ ҳангоми реаксия ҳамчун ордината дахл дорад.

Каҷи аълои тақвият бояд хусусиятҳои зеринро дошта бошад: сатњи асосї њамвор аст ё каме паст шуда, тамоюли болоравии аёнї вуљуд надорад;нуқтаи гардиши каҷ равшан аст ва нишебии марҳилаи экспоненсиалӣ ба самаранокии пурқувват мутаносиб аст.Чӣ қадаре ки нишеб зиёдтар бошад, самаранокии амплификация баландтар аст;каљи умумии пурќувват Параллелизм хуб аст, ки нишон медиҳад, ки самаранокии пурқувват кардани ҳар як найчаи якхела аст;марҳилаи экспоненсиалии хатти тақвияти намунаҳои консентратсияи паст равшан аст.

Базавӣ (базавӣ)
Сатҳи асосӣ сатҳи садои давраи ибтидоӣ мебошад, одатан дар байни давраҳои 3-юм ва 15-ум чен карда мешавад, зеро афзоиши қимати флуоресцентие, ки аз маҳсулоти пурқувват ба вуҷуд омадааст, дар ин давра муайян карда намешавад.Миқдори давраҳое, ки барои ҳисоб кардани хатти асосӣ истифода мешаванд, метавонанд гуногун бошанд ва агар миқдори зиёди қолабҳо истифода шаванд ё сатҳи ифодаи гени мақсаднок баланд бошад, метавонад кам карда шавад.

Муқаррар кардани хатти асосӣ дидани маълумоти флуоресцентиро аз хати каҷи тақвияти хаттӣ талаб мекунад.Сатҳи асосӣ тавре муқаррар карда шудааст, ки афзоиши хатти пурқувват бо рақами давра аз рақами болоии давраи асосӣ оғоз шавад.Барои ҳар як пайдарпаии мақсаднок бояд ба таври алоҳида муқаррар карда шавад.Қиматҳои миёнаи флуорессенсияро, ки дар давраҳои аввал муайян шудаанд, бояд аз арзишҳои флуорессенсияе, ки дар маҳсулоти пурқувватшуда гирифта шудаанд, хориҷ кардан лозим аст.Версияҳои охирини нармафзори гуногуни PCR-и Real-Time имкон медиҳанд, ки ба таври худкор танзимоти асосӣ барои намунаҳои инфиродӣ оптимизатсия карда шаванд.

Дар давоми чанд давраҳои аввали реаксияи пурқувваткунии ПТР, сигнали флуоресцентӣ чандон тағир намеёбад.Наздик шудан ба хати ростро хатти асосӣ меноманд, аммо агар мо ба чанд давраҳои аввал бодиққат нигоҳ кунем, мебинем, ки дар дохили хатти асосӣ он чизест, ки дар расми зер рӯй дода истодааст.

Замина Замина ишора мекунад
арзиши флуоресценти ғайримахсус дар реаксия.Масалан: хомӯш кардани флуоресценти бесамар;ё шумораи зиёди қолибҳои ДНК-и дукарата бо сабаби истифодаи SYBR Green.Қисмҳои заминавии сигнал аз ҷониби алгоритми нармафзори PCR Real-Time ба таври математикӣ хориҷ карда мешаванд.

сигнали мухбир
Сигнал гузоришдиҳанда ба сигнали флуоресцентӣ, ки аз ҷониби SYBR Green ё зондҳои пайдарпаии флюоресцентӣ дар вақти воқеӣ дар вақти PCR тавлидшуда ишора мекунад.

Сигнали муқарраршудаи гузоришдиҳанда (RN)
RN ба шиддатнокии флуорессенсияи ранги репортер ишора мекунад, ки ба шиддатнокии флуорессенси рангҳои истинодӣ дар ҳар як давра чен карда мешавад.

Ранги истиноди пассивӣ
Дар баъзе PCR-ҳои вақти воқеӣ,ранги флуоресценти ROX ҳамчун истинод дар дохили барои ба эътидол овардани сигнали флуоресцентӣ истифода мешавад.Он тағиротҳоро аз сабаби нодурусти пиптинг, мавқеъи чоҳ ва тағирёбии флуорессенсия дар асоси хуб ислоҳ мекунад.

Ҳадди флуоресцентӣ (ҳадди остона)
болотар аз арзиши замина ва ба таври назаррас поёнтар аз арзиши платои каҷи пурқувват тасҳеҳ карда шуд.Он бояд дар минтақаи хаттии хатти пурқувват ҷойгир бошад, ки диапазони лог-хатии муайянкунии PCR-ро ифода мекунад.Ҳадди ақаллҳо бояд дар намуди каҷи лог-амплификация муқаррар карда шаванд, то марҳилаи лог-хатии PCR ба осонӣ муайян карда шавад.Агар дар PCR воқеии вақт якчанд генҳои мақсаднок мавҷуд бошанд, ҳадди ақал бояд барои ҳар як ҳадаф муқаррар карда шавад.Умуман, сигнали флуорессенси 15 давраи аввали реаксияи PCR ҳамчун сигнали заминавии флуорессенсия истифода мешавад ва ҳадди флуорессенсия 10 маротиба аз инҳирофи стандартии сигнали флуорессенси аз 3 то 15 давраи аввали ПЗР аст ва ҳадди флуорессенсия дар марҳилаи амплон муқаррар карда мешавад.Умуман, ҳар як асбоб пеш аз истифода ҳадди флуоресцентии худро дорад.

Ҳадди давра (CT) ё нуқтаи убур (CP)
Даврае, ки дар он хатти пурқувват аз ҳадди остона мегузарад (яъне нуқтае, ки дар он муайянкунии флуоресцент ба таври назаррас меафзояд).CT метавонад як каср бошад ва миқдори қолаби ибтидоиро ҳисоб кардан мумкин аст.Қимати CT шумораи давраҳоеро ифода мекунад, ки вақте сигнали флуоресцентӣ дар ҳар як найчаи реаксияи PCR ба ҳадди муқарраршуда мерасад.Байни арзиши CT-и ҳар як қолаб ва логарифми рақами нусхаи ибтидоии қолаб робитаи хатӣ вуҷуд дорад.шумораи нусхаи ибтидоӣ баландтар бошад, арзиши CT ҳамон қадар хурдтар аст ва баръакс.Каҷи стандартиро бо истифода аз стандарт бо рақами нусхаи ибтидоии маълум сохтан мумкин аст, ки дар он абсцисса арзиши CT ва ордината логарифми рақами нусхаи ибтидоиро ифода мекунад.Аз ин рӯ, то даме ки арзиши CT-и намунаи номаълум ба даст оварда мешавад, рақами нусхаи ибтидоии намунаро аз каҷи стандартӣ ҳисоб кардан мумкин аст.

Арзиши ΔCT
Арзиши ΔCT тавсиф мекунадфарқияти байни гени мақсаднок ва арзиши гени истинодҳои эндогении мувофиқи CT, ба монанди гени хонагӣ ва барои ба эътидол овардани миқдори қолаби истифодашуда истифода мешавад:
⇒ΔCT = CT (гени мақсаднок) - CT (гени истинодҳои эндогенӣ)

Арзиши ΔΔCT
Қимати ΔΔCT фарқи байни арзиши миёнаи ΔΔCT-и намунаи мавриди таваҷҷӯҳ (масалан, ҳуҷайраҳои ҳавасмандшуда) ва арзиши миёнаи ΔΔCT-и намунаи истинод (масалан, ҳуҷайраҳои бе ҳавасманд) тавсиф мекунад.Намунаи истинод инчунин намунаи калибрченкунӣ номида мешавад ва ҳамаи намунаҳои дигар ба ин барои миқдори нисбӣ муқаррар карда мешаванд:
⇒ΔΔCT = миёнаи ΔCT (намунаи таваҷҷӯҳ) – миёнаи ΔCT (намунаи истинод)

Генҳои истинодҳои эндогенӣ (генҳои истинодҳои эндогенӣ)
Сатҳи ифодаи генҳои истинодҳои эндогенӣ, ба монанди генҳои хонагӣ (генҳои хонагӣ) дар байни намунаҳо фарқ намекунанд.Муқоисаи арзишҳои CT-и гени истинод ба гени ҳадаф имкон медиҳад, ки сатҳи ифодаи гени мақсаднок ба миқдори RNA ё cDNA-и воридшаванда ба эътидол оварда шавад (нигаред ба фасли арзишҳои ΔCT дар боло).

Генҳои истинодҳои дохилӣ бароитаназзули эҳтимолии РНК ё мавҷудияти ингибиторҳои фермент дар намунаҳои РНК, инчунин тағирот дар таркиби РНК, самаранокии транскрипсияи баръакс, барқарорсозии кислотаи нуклеинӣ ва коркарди намуна.Барои интихоби ген(ҳо)-и оптималии истинод, мо алгоритмро тағир додем, то интихоби он аз истинодҳои оптималии вобаста ба танзимоти таҷрибавӣ имкон диҳад.

Назорати дохилӣ
пайдарпаии назорат, ки дар як реаксия бо пайдарпаии мақсаднок пурзӯр карда мешавад ва бо зондҳои дигар санҷида мешавад (яъне, иҷрои PCR дуплекс).Назорати дохилӣ аксар вақт барои истисно кардани амплификацияҳои ноком истифода мешавад, масалан, вақте ки пайдарпаии ҳадаф ошкор карда намешавад.
Намунаи калибрченкунӣ
Намунаи истинод (масалан, РНК-и тозашуда аз хати ҳуҷайра ё матоъ), ки дар миқдори нисбӣ барои муқоисаи ҳама намунаҳои дигар барои муайян кардани сатҳи нисбии ифодаи ген истифода мешавад.Намунаи калибрченкунӣ метавонад ҳама гуна намуна бошад, аммо одатан назорат аст (масалан, намунаи коркарднашуда ё намуна аз вақти сифри таҷриба).

Назорати мусбӣ
реаксияхои назоратро бомиқдори маълуми қолаб.Назорати мусбӣ аксар вақт барои тафтиш кардани дуруст кор кардани маҷмӯи праймер ё маҷмӯи праймер-зонд ва дуруст танзим шудани реаксия истифода мешавад.

Бе назорати Шаблон (NTC)
Реаксияи назоратӣ, ки дорои ҳама ҷузъҳои зарурии реаксияи амплификатсия, ба истиснои қолаб, ки одатан бо об иваз карда мешавад.Истифодаи NTC метавонад ифлосшавии ифлосшавии реактив ё ДНК-и хориҷиро пайдо кунад ва ҳамин тавр ҳақиқӣ ва эътимоднокии маълумоти ошкоршударо таъмин кунад.Амплификатсияи назорати NTC аз ифлосшавӣ шаҳодат медиҳад.

Бе назорати RT (NRT)
Раванди истихроҷи РНК метавонад дорои ДНК-и геномии боқимонда бошад, ки бениҳоят зараровар аст ва гунаҳкор ба сифати додаҳо ва душмани табиии qPCR таъсир мерасонад, аз ин рӯ ҳангоми тарҳрезии таҷрибаҳо он бояд танҳо барои тақвияти кашфи РНК тарҳрезӣ шавад.Ду роҳ вуҷуд дорад, яке тарҳрезии праймерҳо дар байни интронҳо, дигаре комилан хориҷ кардани ДНК мебошад, ки кадоме аз онҳо беҳтар аст, ки баъдтар баррасӣ хоҳад шуд.Назорати NTR оинаи ҷодугарест, ки ифлосшавии ДНК-ро ошкор мекунад.Агар амплификация вуҷуд дошта бошад, ин маънои онро дорад, ки ифлосшавӣ вуҷуд дорад.

Стандартҳо
Стандартҳо намунаҳои консентратсияи маълум ё рақами нусхабардорӣ мебошанд, ки барои сохтани хатти стандартӣ истифода мешаванд.Барои таъмини устувории стандарт, порчаи ген одатан ба плазмид клон карда мешавад ва ҳамчун стандарт истифода мешавад.

Хатти стандартӣ
одатан ба ҳадди ақал 5 градиенти консентратсия бо маҳсулоти стандартӣ мувофиқи таносуби дукарата омехта карда мешавад ва 5 нуқта дар координатҳои арзиши CT ва рақами нусхабардорӣ кашида мешавад ва нуқтаҳо пайваст карда мешаванд, то хати эҷоди каҷи стандартиро ташкил кунанд.Барои ҳар як хатти стандартӣ, дурустии он бояд тафтиш карда шавад.Қимати нишеб аз -3,3 то -3,8 меафтад ва ҳар як консентрат дар се маротиба иҷро карда мешавад.Нуқтаҳое, ки аз нуқтаҳои дигар хеле фарқ мекунанд, бояд партофта шаванд.Арзиши CT-и намунаи санҷидашаванда ба каҷи стандартӣ оварда мешавад ва сатҳи ифодаи намунаи санҷидашаванда ҳисоб карда мешавад.

Қимати CT-и намунаи санҷидашаванда ба хатти стандартӣ оварда мешавад ва рақами нусхаи ибтидоии намунаи санҷишшавандаро ҳисоб кардан мумкин аст.

Самаранокӣ ва нишебӣ
Нишебии каҷи стандартӣ самаранокии PCR-ро дар вақти воқеӣ нишон медиҳад.
· Нишебии -3,322 нишон медиҳад, ки самаранокии пурқувваткунии PCR 1 ё 100% самаранок аст ва миқдори маҳсулоти PCR дар ҳар як давра дучанд мешавад.
· Нишебии камтар аз -3,322 (масалан, -3,8) самаранокии PCR-ро нишон медиҳад
· Нишебии бузургтар аз -3,322 (масалан, -3,0) нишон медиҳад, ки самаранокии PCR аз 100% зиёдтар аст, ки аҷиб аст, ки чӣ гуна як давраи PCR метавонад маҳсулоти пурқувватшударо бештар аз ду маротиба тавлид кунад?Ин ҳолат дар марҳилаи ғайрихаттии реаксияи ПТР ба амал меояд, яъне миқдори зиёди амплификацияи ғайримуқаррарӣ вуҷуд дорад.

каҷи обшавии
Пас аз ба итмом расидани тақвияти qPCR, маҳсулоти PCR гарм карда мешавад.Бо баланд шудани ҳарорат, маҳсулоти пурқувваткунандаи дуқабата тадриҷан об мешавад, ки дар натиҷа шиддатнокии флуоресцентсия коҳиш меёбад.Ҳангоми расидан ба ҳарорати муайян (Тм) миқдори зиёди маҳсулот об мешавад.Флуоресцентсия якбора паст мешавад.Маҳсулотҳои гуногуни PCR дорои арзишҳои гуногуни Tm ва ҳарорати гудохтани гуногун мебошанд, то ки хусусияти ПЗР муайян карда шавад.

Каҷи обшавӣ (қаҷи ҳосилшуда)
Каҷи обшавӣ барои ташкили харитаи авҷ гирифта шудааст, ки метавонад вазъияти порчаҳои маҳсулоти PCR-ро ба таври интуитивӣ нишон диҳад.дарозии маҳсулоти пурқувватшуда дар ҳудуди 80-300bp аст, бинобар ин ҳарорати обшавӣ бояд аз 80 ° C то 90 ° C бошад.

Тафсири хатти обшавии: Агар ягона қуллаи асосӣ дар байни 80°C-90°C пайдо шавад, ин маънои онро дорад, ки PCR-и миқдории флюоресцентӣ комил аст;агар қуллаи асосӣ дар байни 80°C-90°С пайдо шавад ва қуллаҳои гуногун дар зери 80°C пайдо шаванд, димери ибтидоӣ асосан ба назар гирифта мешавад.Шумо метавонед кӯшиш кунед, ки ҳарорати гармкуниро зиёд кунед, то онро ҳал кунед;

Албатта, ҳанӯз ҳам баъзе ҳолатҳои ғайримуқаррарӣ мавҷуданд, ки дар поён як ба як тақсим карда мешаванд.
3. Дониши мукаммал

Барои иҷрои qPCR, ман бояд MIQE бигӯям,Маълумоти ҳадди ақалбарои нашриМиқдорӣPCR дар вақти воқеӣТаҷрибаҳо -маълумоти ҳадди ақал барои нашри мақолаҳо дар бораи PCR-и миқдории воқеӣтаҷрибаҳо.Барои содда кардани фаҳмиши ҳама, мо мундариҷаи асосиро содда мекунем.

Шумо метавонед матни аслии MIQE-ро дар Интернет ҷустуҷӯ кунед ва аз ҳама муҳимаш он аст, ки дар онрӯйхати маълумоте, ки ҳангоми нашри мақола бояд пешниҳод карда шаванд .

Тафсиркунандагон метавонанд бо хондани ин тафсилот ба сифати озмоиш доварӣ кунанд;хонандагони оянда низ метавонанд инро барои такрор ё такмил додани таҷриба истифода баранд.
Қобили зикр аст, ки дар ин рӯйхат аҳамияти ҳар як рӯйхат мутаносибан бо E ё D ишора шудааст.Ин чӣ маъно дорад?E: маълумоти муҳим (бояд пешниҳод карда шавад);D: маълумоти дилхоҳ (то ҳадди имкон пешниҳод кунед).

MIQE (1) — Тарҳрезии таҷрибавӣ
Хамин тавр ахлокхо сохта мешаванд!

Ба хона наздиктар, аввалин принсипи таҷриба муайян кардан астсахтгирии мантиқи таҷрибавӣ.

Намунаи мақсаднокба намунае дахл дорад, ки аз мо талаб мекунад, ки гени мақсаднокро пас аз табобати муайян муайян кунем.Намунаи истиноднамунаи бе ягон табобат аст, ки аксар вақт дар биология навъи ваҳшӣ номида мешавад.

Такрори таҷрибавӣхеле муҳиманд.Умуман, шумораи такрори боварибахш бояд аз се зиёд бошад.Фарқ кардан лозим аст, ки репликатсияи биологӣ чист ва репликатсияи техникӣ чист.

Репликатсияҳои биологӣ: Таҷрибаи якхелаи санҷишӣ бо маводҳои гуногун анҷом дода шудааст (вақт, растаниҳо, партияҳо, лавҳаҳои реаксия).

Дурнамои биологӣ
Барои мисол коркарди пестисидҳои қаламфурро мегирем.Барои B ва C низ ҳамин тавр кунед.

Репликатҳои техникӣ (Репликатҳои техникӣ): Ин як озмоиши такрорист, ки барои пешгирӣ кардани хатогиҳо дар натиҷаи амалиёт пешбинӣ шудааст, ки дар асл як сӯрохи такрорӣ мебошад, ки ба ҳамон мавод дохил карда шудааст.Ҳарду табобат ва назорат бояд танзимоти такрорӣ (ҳадди ақал се) гени мақсаднок ва гени истинодҳои дохилӣ дошта бошанд.

Такрори техникӣ
Боз ќаламфури бо пеститсид коркардшударо мисол гиред.Барои назорати растании А Гурӯҳҳо низ ҳамин тавр муносибат мекунанд.Ба ҳамин монанд, барои растаниҳои B ва C як табобатро анҷом диҳед.Ин такрори техникӣ аст.

Бояд гуфт, ки

Назорати манфӣ - NTC ва NRT
NTC (Назорати Шаблон), назорати бе қолаб, барои тафтиши олуда будани маводи таҷрибавӣ истифода мешавад.Агар реаксияи флуоресцентӣ вуҷуд дошта бошад, ин нишон медиҳад, ки дар лаборатория ифлосшавии кислотаи нуклеинӣ рух додааст.

Пайдо кардани ифлосшавии аэрозол аз ҳама мушкил аст.Тасаввур кунед, ки лабораторияи шумо мисли дуд аст, ки дар ҳаво кислотаҳои гуногуни нуклеинӣ доранд.

NRT (Транскриптаза нест), назорат бидуни транскрипсияи баръакс, РНК-и транскрипсияи баръакс ҳамчун назорати манфӣ, ки назорати пасмондаҳои gDNA мебошад.

Ҳангоми ифодаи ген, миқдори РНК тавассути муайян кардани миқдори cDNA пас аз транскрипсияи баръакс муайян карда мешавад.Дар сатҳи умумӣ, на танҳо cDNA, gDNA бояд ҳангоми истихроҷи РНК комилан хориҷ карда шавад.

MIQE (2) — маълумоти намунавӣ
Ба ҳамин монанд, вақте ки мо намунаҳоро коркард мекунем, мо бояд амалиёти худро низ танзим кунем, то дурустии намунаҳоро таъмин кунем.

Тавсифи намуна танҳо натиҷа аст ва мо бояд ба маводи дар давоми тамоми таҷриба гирифташуда бештар диққат диҳем.

Интихоби маводи таҷрибавӣ
Намунаҳои хун - хуни тозаро интихоб кунед, на бештар аз 4 соат.Намунаҳои ҳуҷайра - ҷамъоварии ҳуҷайраҳои тару тозаро дар давраи афзоиши қавӣ интихоб кунед.Бофтаи ҳайвонот - бофтаи тару тоза ва қавӣ афзояндаро интихоб кунед.

Шумо бояд пай бурдед, ки дар ин чанд ҷумла як калимаи калидӣ мавҷуд аст: тару тоза.

Маҷмӯаи мини ДНК хун

Маҷмӯаи изолятсияи умумии RNA ҳуҷайра

Маҷмӯаи изолятсияи умумии RNA Animal

Маҷмӯаи изолятсияи ДНК-и растанӣ

Умуман, мо нигоҳ доштани намунаҳоро тавсия намедиҳем, агар шароит иҷозат диҳад.

Барои ин гуна рафики мехнатдуст факат гуфтан мумкин аст, ки шумо масолехи реактивиро намефахмед.Ҳоло бисёре аз ширкатҳои масрафи реагентҳо реагентҳое истеҳсол мекунанд, ки метавонанд намунаҳои РНК-ро дар ҳарорати хонагӣ нигоҳ доранд ва шумо метавонед онҳоро истифода баред.Усули анъанавии нигоҳдорӣ ин нигоҳдории нитрогени моеъ мебошад, ки бо истифода аз як зарфи хурди нитрогени моеъ, ки интиқолаш осон аст.

вазуд .

зуд,.

Аз ин рӯ, ба маънои, кӯтоҳтар вақти истихроҷи, беҳтар маҷмӯаи.Чаро мекунадФориҷӣ

Шарҳ

Гарчанде ки таҷрибаҳои биологӣ душвор бошанд ҳам, онҳо дараҷаи олӣ доранд.Агар шумо эҳтиёт нашавед, шумо метавонед ҷаҳонро чаппа кунед.Масалан, табдил додани SARS ба бӯҳрони биохимиявӣ ё сохтани биринҷи гибридӣ барои наҷот додани 1,3 миллиард нафар.Фаромӯш накунед, ӯро сиёҳ накунед.

Пеш аз ҳама, биёед мундариҷаи MIQE-ро дар бораи истихроҷи кислотаи нуклеинӣ нусхабардорӣ кунем.

Ба ин шакл назар карда, дар руи замин мондан мумкин нест.Шакл як догма аст.Барои донишҷӯи беҳтарин шудан, шумо бояд пурсед, ки чаро.Мундариҷаи асосии ин ҷадвал ин аст: Пайравӣ .

Қисми якумираванд ё асбоб қадами истихроҷи кислотаи нуклеинӣ мебошад.

Номи маҷмӯа ва

Баъзехо хангоми гирифтани намунахои махсус баъзе реактивхои махсус илова мекунанд ва гумон мекунанд, ки ин аслихаи махфии онхост ва ба дигарон намегуяд.Дар ҳоле ки онро махфӣ нигоҳ медоранд, онҳо инчунин имкони дурахшон кардани мақолаи шуморо аз даст медиҳанд.Доно нашав, дар пажӯҳишҳои илмӣ аз Чжани пири кишвар ростқавлонатар бошӣ, агар доно бошӣ, мақола туро аблаҳ мекунад.

Илова бар ин, рақами CAS аксар вақт ҳангоми фармоиш додани реагентҳои биохимиявӣ истифода мешавад ва ман онро якҷоя маъмул мекунам.Рақами CAS рақамест, ки аз ҷониби Ҷамъияти кимиёвии Амрико ба ҳар як доруи нави кимиёвӣ дода мешавад.Одатан, се рақам бо тире пайваст карда мешавад.Рақами CAS Рушуи: 7732-18-5.Химияҳо аксар вақт тахаллусҳои сершумор доранд, аммо рақами CAS беназир аст.Ҳангоми фармоиш додани дору, шумо метавонед аввал рақами CAS-и онро тафтиш кунед.

Ба хона наздиктар, чаро мо бояд ин чизҳоро равшан тасвир кунем?Дар асл, он инчунин санҷиши сифати истихроҷи РНК аст.Истифодаи асбобҳо ва маҷмӯаҳо истихроҷи РНК-ро устувортар мегардонад.Миқёси истихроҷи лабораторияҳои оддӣ калон нест ва онро бо маҷмӯаҳо ба даст овардан мумкин аст.

Умуман, усули бартараф кардани ДНК ин коркарди РНК бо DNase пас аз истихроҷ мебошад.Аммо, ин усулҳои нисбатан кӯҳна мебошанд.Маҷмӯаҳои истихроҷи РНК-и тиҷоратӣ тавонистанд ДНК-ро дар ҷараёни истихроҷ бидуни илова кардани DNase хориҷ кунанд.Масалан, як қатор маҷмӯаҳо аз Foregene .

ШарҳАсосан, ин як савдои байни ҳосили РНК ва тозагӣ мебошад.

DNase-и оптимизатсияшуда зуд ва пурра ҳазм карда намешавад.Ин санҷиши сатҳи техникии савдогар аст.Албатта, боз ҳам тоҷирони аҷибтаре ҳастанд, ки фахр мекунанд, ки ДНК-ро бидуни DNase хориҷ кардан мумкин аст.Метавон гуфт, ки ҳар касе, ки лоф мезанад, ки ДНК-ро бидуни DNase комилан хориҷ кардан мумкин аст, авбош аст.ДНК як сохтори нисбатан устувори дуқабата буда, онро танҳо бо сӯҳбат ва хандидан нест кардан мумкин нест.

Арзёбии ифлосшавӣ
Усули баҳодиҳӣ: муайянкунии электрофорез, агароза 1%, 6В/см, 15дақ, боркунӣ 1-3 ул.

Таҳлили миқдори кислотаи нуклеинӣ
одатан бо истифода аз спектрофотометри ултрабунафш чен карда мешавад.Биёед ман аввал маънои се арзиши OD260, OD280 ва OD230-ро маъмул созам.
·OD260nm: Ин дарозии мавҷи азхудкунии баландтарин қуллаи азхудкунии кислотаи нуклеинӣ мебошад ва арзиши беҳтарини ченшуда аз 0,1 то 1,0 аст.Дар акси ҳол, намунаро маҳлул кунед ё консентратсия кунед, то онро ба доираи диапазон оваред.
· OD280NM: Ин дарозии азхудкунии мавҷи азхудкунии баландтарин абстралистии моддаҳои сафеда ва phenolic мебошад.
·OD230nm: Ин дарозии мавҷи азхудкунии баландтарин қуллаи ҷабби карбогидратҳо мебошад.

Баъд, биёед дар бораи нақши ҳар як нишондод сӯҳбат кунем.Барои A260, он метавонад барои чен кардани ҳосили кислотаи нуклеин истифода шавад.Вақте ки OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Барои покӣ, мо бояд ба таносубҳое, ки одатан мебинем, назар кунем: OD260/280 ва OD260/230.
·ДНК-и пок: OD260/280 тақрибан ба 1,8 баробар аст.
· РНК тоза: 1.7

якпорчагии РНК

Андозаи якпорчагии РНК хеле муҳим аст.Вақте ки банди сеюми 5S пайдо мешавад, ин маънои онро дорад, ки РНК ба таназзул шурӯъ кардааст, ба истиснои ҳайвоноти сутунмӯҳрана.

Аз ин рӯ, дар раванди нигоҳдории намунаи РНК, истихроҷи РНК ва ғайра, ҳадафи асосӣ таъмини якпорчагии РНК мебошад.

Диаграммаи схематикии гени мақсаднок ва гени истинод набояд дуруст бошад

Санҷиши монеъшавӣ (оё арзиши КТ дар консентратсияи баланд ё паст ё дигар шароитҳо пахш карда мешавад)

Ин рақамро ҳамчун мисол гирифта, арзишҳои Ct-и панҷ каҷ чунинанд.

Идеяи нодуруст ин аст: истихроҷи РНК танҳо ҳосилро пайгирӣ мекунад ва фикр мекунад, ки миқдори РНК ҳар қадар зиёдтар бошад, ҳамон қадар беҳтар аст.Дар асл, вақте ки мо миқдорро анҷом медиҳем, агар шумораи генҳо он қадар зиёд набошад, ба мо РНК-и зиёд лозим нест.Миқдори РНК, ки шумо истихроҷ мекунед, беш аз кофист.

Консепсияи дуруст ин аст:Истихроҷи РНК бояд покӣ, якпорчагӣ ва мувофиқатро пайгирӣ кунад.Покӣ метавонад кафолат диҳад, ки транскрипсияи баръакси минбаъда монеъ намешавад ва ба маълумот аз ҷониби ДНК таъсир намерасонад.Беайбӣ мувозинати пайдарпайии мақсаднок ва истинодҳои дохилиро таъмин мекунад.Пайвастагӣ боркунии устувори намунаро таъмин мекунад.

MIQE (4) – транскрипсияи баръакс
Фикри нодуруст: ҷустуҷӯи ҳаҷми бештари намуна.
Консепсияи дуруст
Мо ин равандро бо диаграммаи схематикӣ шарҳ медиҳем:

Диаграммаи схематикии самаранокии транскрипсияи баръакс, дуруст нест
Пеш аз ҳама, мо бояд фарқи байни раванди транскрипсияи баръакс ва раванди PCR-ро фаҳмем.PCR равандҳои гармидиҳӣ ва гармкуниро аз сар мегузаронад ва порчаи мақсаднок ба таври экспоненсиалӣ меафзояд;

чунон ки вуҷуд доранд, ҳар қадар пораҳои Маълумоти cDNA ба даст оварда метавонанд, он бояд ҳоло дарк карда шавад, зеро порчаҳои хурду калон баръакс транскрипсия карда шудаанд ва ба як порча таваҷҷӯҳ кардан ғайриимкон аст.Ва азбаски миқдори РНК нисбатан хурд аст, миқдори cDNA-и ба даст овардашуда низ нисбатан хурд аст, бар хилофи PCR, ки таъсири амплификация дорад, аз ин рӯ ошкор кардан ғайриимкон аст.

Натиҷаҳои электрофорези cDNA

Пас, чӣ гуна метавон тафтиш кард, ки оё самаранокии транскрипсияи баръакс устувор аст?Усули хеле содда аст, ба шумо танҳо санҷиши муқоисавӣ лозим аст: яке аз он иборат аст, ки пас аз дукаратаи разряди РНК ба cDNA баръакс транскриптатсия кунед ва дигаре ин аст, ки пас аз транскрипсияи баръакс ба cDNA дучанд зиёд кунед ва сипас qPCR кунед, то нишебии бадастомадаро бубинед.Ҳамчун як донишҷӯи беҳтарин, шумо бояд онро дар сонияҳо фаҳмед.Тавре ки дар зер нишон дода шудааст:

Раванди РНК ва cDNA барои санҷидани он, ки самаранокии транскрипсияи баръакс устувор аст
Транскриптаза ва маҷмӯаи баръакс
Чӣ гуна метавонад PCR-и мукаммали флуоресцентӣ транскриптаза ва маҷмӯаи аълои баръакс дошта бошад.Транскриптазаи баръакс аз рӯи манбаъ тақрибан ба ду намуд тақсим мешавад, AMV ёM-MLV, ва иҷрои онҳо якхела аст, ки дар ҷадвал нишон дода шудааст.

Фаъолияти RNase H
RNase H Рибонуклеаза H аст, номи чинӣ рибонуклеаза Н аст, ки эндорибонуклеаза аст, ки метавонад РНК-ро дар занҷири гибридии ДНК-РНК махсусан гидролиз кунад.RNase H наметавонад пайвандҳои фосфодиэфириро дар ДНК ё РНК-и якқатор ё дуқатор гидролиз кунад, яъне ДНК ё РНК-и якқатор ё дуқаторро ҳазм карда наметавонад.Одатан дар синтези риштаи дуюми cDNA истифода мешавад.

Ин як чизи аҷиб аст.Мо мегӯем, ки транскриптазаи баръакс дорои фаъолияти RNase H аст, на ин ки транскриптазаи баръакс дорои RNase H мебошад ва мумкин нест, ки RNase H аз транскриптазаи баръакс ҷудо карда шавад, шояд аз сабаби мувофиқати гурӯҳҳои муайян дар транскриптазаи баръакс Ин фаъолият тавассути транскриптазаи баръакс ба вуҷуд омадааст.

Аз ин рӯ, новобаста аз самаранокии баланди транскрипсияи баръакси AMV, фаъолияти RNase H-и он ҳосили cDNA-ро коҳиш медиҳад.Албатта, истеҳсолкунандагони реактивҳо пайваста маҳсулоти худро оптимизатсия мекунанд, то фаъолияти RNase H-ро дар транскриптазаи баръакс ба қадри имкон зиёд кунанд, то ҳосили cDNA-ро зиёд кунанд.
Ҳарорати тозакунӣ

Барои сохтори дуюмдараҷаи РНК дар ҳароратҳои гуногун ба расми боло нигаред ва асбоби онлайни mFold-ро барои муайян кардани сохтори дуввуми порчаи ҳадаф дар шароити мушаххаси ҳарорат ва консентратсияи намак истифода баред.Дар 55°С сохтори дуюмдараҷаи РНК ҳоло ҳам хеле мураккаб аст, транскриптазаи баръакс кор карда наметавонад ва сохтори дуюмдараҷа то 65°С комилан ҳал намешавад, дар ҳоле ки ҳарорати оптималии AMV ва M-MLV аз ин ҳарорат хеле пасттар аст.
чӣ бояд кард?Сохтори дуюмдараҷа ҷуфтшавии иловагии худи шаблон мебошад, ки боиси рақобати шадид байни транскриптаза ва транскриптазаи баръакс ва қолаб мегардад, ки дар натиҷа як қатор мушкилот ба монанди пасти E ва такрорпазирии заиф мегардад.

чӣ бояд кард?Танҳо ҳарорати гармкуниро то ҳадди имкон зиёд кунед.

Бисёре аз истеҳсолкунандагони реактивҳо транскриптазаи баръакси худро тавассути муҳандисии генетикӣ такмил медиҳанд.Баъзеҳо ҳарорати реаксияро баланд мекунанд, ба монанди Ҷифан ва Айделай ва баъзеҳо гурӯҳи фаъоли ферментҳои RNase H-ро хориҷ мекунанд, то наздикии байни фермент ва қолаби РНК беҳтар шавад.Муносибати баланд метавонад сохтори дуюмдараҷаро ба таври рақобатӣ фишурда кунад ва ба осонӣ хонда шавад ва инчунин самаранокии транскрипсияи баръаксро хеле беҳтар кунад.
Нуқтаи асосӣ: Транскрипсияи баръакс барои пайгирии пайвастагии самаранокии транскрипсияи баръакс муҳимтар аст (ферментҳо бояд на танҳо самаранок, балки устувор бошанд), на ба миқдори намунаи боршуда, агар он як ПЗР-и миқдории флуоресцентии миқёси махсусан калон набошад, он тамоман имконнопазир аст.Якчанд cDNA.
Истеҳсолкунандагони гуногун низ дар ҷустуҷӯи мувофиқат кӯшишҳои зиёд ба харҷ доданд.Масалан, аксарияти ширкатҳо ҳоло транскрипсияи баръаксро ҳамчун маҷмӯаи стандартӣ барои фурӯш бастаанд, ки ин интихоби хуб аст.
Масалан, маҷмӯаҳои RT Easy Series Foregene:

MIQE (5) - иттилооти генҳои мақсаднок

Рақами боло шарҳ медиҳад
1. Оё ин ген барои таҷрибаҳои такрорӣ самаранок аст ё не, одатан тавассути таҷрибаҳои такрорӣ санҷида мешавад.
2. Шумо медонед, ки ген ID.
3. Дарозии ген, дарозии умумии гени ҳадаф бешубҳа мушкиле нест.Ҳангоми тарҳрезии праймерҳо, боварӣ ҳосил кунед, ки дарозии ампликон дар байни 80-200bp бошад, то самаранокии беҳтари тақвиятро таъмин кунад.
4. Маълумот дар бораи муқоисаи Blast, гени мақсаднок бояд дар генбонк муқоиса карда шавад, то амплификацияи ғайримуқаррариро пешгирӣ кунад.
5. Мавҷудияти псевдогенҳо.Псевдоген як пайдарпаии ДНК мебошад, ки ба гени муқаррарӣ монанд аст, аммо вазифаи муқаррарии худро гум мекунад.Он аксар вақт дар оилаи бисёр гении эукариотҳо мавҷуд аст.Он одатан бо ψ ифода карда мешавад.Ин як нусхаи геномии ДНК-и ғайрифунксионалӣ дар геном аст, ки ба пайдарпаии генҳои рамзгузорӣ хеле монанд аст., умуман транскрипция карда нашудаанд ва маънои физиологии равшан надоранд.

Схематикӣ, ҳеҷ гоҳ дуруст нест
Пас роҳи беҳтарини пешгирии ифлосшавии ДНК ин нест кардани ДНК мебошад.
7. Пешгӯии конформатсия.

MIQE (6) - qPCR олигонуклеотидҳо

Барои PCR-и миқдории флуоресцентӣ, аввалин чизе, ки шумо бо ҳар рӯз мубориза мебаред, истихроҷи РНК аст ва чизи дуюм метавонад тарҳи праймер бошад.

Дар робита ба принсипҳои тарҳрезии праймер, ба шумо лозим нест, ки онҳоро бо ёдоварӣ аз ёд кунед, зеро аксари нармафзори тарҳрезии праймер ё абзорҳои онлайн метавонанд ин мушкилотро ҳал кунанд (асбоби онлайн тавсияшаванда primer3.ut.ee/) ва 99,999% тарҳрезии праймер дастӣ иҷро карда намешавад. Нигоҳ кунед, муаллиф баъзан садҳо праймерҳоро дар як рӯз тарроҳӣ мекунад, агар шумо як ба як хонед, он хатсайр мешавад.
Танҳо пас аз тарҳрезии праймерҳо нуктаҳои зеринро тафтиш кунед:

Чаро праймерҳо бояд ба охири 3' наздик тарҳрезӣ шаванд, ин набояд дуруст бошад
2. Қимати ТМ: Қимати Tm дар 55-65°С (зеро фаъолияти экзонуклеаз баландтарин дар 60°С аст) ва таркиби GC дар 40%-60% аст.

MIQE(7) - раванди qPCR

1. Маҷмӯи qPCR


Ферментҳои гарми оғозкунандаи Taq:

Аммо, ин чӣ фоида дорад?Ин аст, ки фаъолияти ферментҳои анибияви метибуршуда нисбат ба эҳсосот кимиёвӣ тағйирёбанда аст, бинобар ин ферментҳо анибия-метибиршуда каме бартаридия доранд, ба тавре ки асосан ферментҳои кимиёвӣ дар бозор нестанд.
Консентратсияи ионҳои магний:
Консентратсияи рангҳои флуоресцентӣ:
PS: Аз сабаби хусусиятҳои ҳассоси худ, маҳсулот дар бозор одатан қубурҳои offrifugh Sentrifugher (тавре ки дар расм нишон дода шудааст, дар расм тасвир шудааст).Бо вуҷуди ин, ин ба мушкилот дучор хоҳад шуд.Дар ин робита, QGEKKE дар ҳақиқат аз ҳама истифодабаранда дӯстона аст (тавре ки дар тасвири зер нишон дода шудааст) ва найчаи шаффоф дар халтаи тунуки тунук ҷойгир карда мешавад.Шумо бояд рақами дурусти маҳсулотро интихоб кунед.

Азбаски SCR-и фантастесент аз арзиши CT вобаста аст, агар консентратсияи рангҳои флуорессия ба таври дуруст танзим карда нашавад, нуқтаи паст аз нуқтаи баланд беҳтар аст.Албатта, консентратсияи ранги мувофиқ беҳтарин аст.

ROX: Рангҳои rox барои ислоҳи хатогиҳои имзои хуб ба хубӣ истифода мешаванд.Баъзе истеҳсолкунандагони асбобҳо калибрчро талаб мекунанд, дар ҳоле ки дигарон не.Масалан, истифодаи вақти воқеии Терммо дар вақти воқеӣ Санъати воқеии PCR ANDICTIONTIONTIONELACTIATION, аз ҷумла 7300, 7500, 7500, 7500, 7500, 7500, 7500, сандуқа ва ғайра тавсиф мекунад.

Kit-Taqman дар вақти воқеӣ PCR

Табобати заифи пайванди гидроген: Табобати вомбаргҳои гидрогенӣ як масъалаи нисбатан техникӣ мебошад.Ҳеҷ чиз дастурҳои маҷмӯаҳои зиёди маҷмӯаро хонда наметавонистанд, аммо ҳеҷ кадоме аз онҳо ин мавзӯъро номбар намекунад.Дар асл, ин хеле муҳим аст.Маҷмӯи пойгоҳ асосан аз тавоноии вомбаргҳои гидроген вобаста аст.Вомбаргҳои сахти гидропикии гидропиксмензияи муқаррарӣ мебошандАгар пайвандҳои заифи гидрогенро хуб нест кардан ғайриимкон бошад, аз тақвияти ғайримуқаррарӣ пешгирӣ кардан мумкин нест.Дар доираи муаллиф, танҳо якчанд ширкатҳо ин мушкилотро мушоҳида кардаанд.Вақте ки шумо маҷмӯаро мехаред, шумо метавонед ба он муроҷиат кунед, ки оё шумо ҳалли ин масъаларо барои маҷмӯае, ки мехоҳед интихоб кунед, баррасӣ кардаед.

Ҳаҷми реаксия: Системаи 20-50UL одатан бештар истифода мешавад ва ҳаҷми хурдтар эҳтимолан ба хатогӣ дучор мешаванд.Умуман, дастурҳои маҷмӯа истифодаи ҳаҷми реаксияи PCR-ро тавсия медиҳанд.Доно нашавед ва барои сарфа кардани хароҷот ҳаҷми хурдтарро истифода баред.максад аз.Ҳаҷми савдогарон воқеан санҷида шуд ва шояд ин масъалаи хатогиҳоеро, ки аз ҳаҷми хурд ба вуҷуд омадаанд, ҳал карда наметавонанд.
2. Истеҳсолкунанда ва рақами санаи зарбаи TUBE
Ҳама принсипи калиди PCR-и флюнесентро медонанд.Ҷамъоварии FloreCEX асосан тавассути сарпӯши PCR-ҳуштҳо гузаронида мешавад.Ҳангоми интихоби имконпазирии PCR, ба ду нуқта диққат диҳед: такрори хуби сабук ва барои асбоб.Умуман, тахтаҳо ва қубурҳои брендии асосӣ хубанд, аммо шумо бояд бодиққат аз ҷиҳати мутобиқшавӣ бодиққат интихоб кунед, вагарна шумо асбобро истифода бурда наметавонед.

4. Дониши сатҳи олӣ

MIQE (8) — тасдиқи qPCR
Ин афзалияти асосии qPCR аст!Дар ин чо бисьёр кахрамонхо ба рег афтодаанд.Албатта, он инчунин имконпазир аст, ки шумо хушбахт бошед ва генҳое, ки шумо омӯхтаед, ба воситаи ғори ях дар баробари шамол шино мекунед.Маълумоти санҷиш дар бораи QPCR барои санҷидани эътимоднокии маълумот пешбинӣ шудааст.Мо маълумоти зарурии санҷишро чунин қайд мекунем:

1. Санҷиши мушаххасот
Тафсири амбизатсияи гениа таҳти мақсаднок аз санҷиши тасвири электрофтория як банд аст;тафтиши пайдарпайӣ;каљ обшавии барои дидани оё харитаи қуллаи ягона аст;тафтиши ҳозима ферментҳо ва усулҳои дигар.
Дар ин ҷо мо ба твай тахлили амплификацияи гайриспецификиро бо усули гудохтани хатхо.Умуман, вақте ки мо дастурҳоро тарроҳӣ мекунем, андозаи қисмҳои маҳсулот бояд дар ҳудуди 80-200BP бошад, ки ҳарорати обшавии PCR-ро 80-85 ° C месозад.Аз ин рӯ, агар қуллаҳои гуногун вуҷуд дошта бошанд, бояд маҳсулоти дигари амплификация вуҷуд дошта бошанд;агар қулла поёнтар аз 80 ° C пайдо шавад, он одатан димери ибтидоӣ ҳисобида мешавад;агар қуллаи баландтар аз 85°С боло бошад, он одатан ифлосшавии ДНК ё бештар амплификацияи ғайримуқаррарии порчаҳои калон ҳисобида мешавад.
Эзоҳ: Баъзан танҳо як қулла дар 80 ° C вуҷуд дорад.Эҳтимол аст, ки натиҷаҳои амплификация ҳама dimers primer мебошанд.

Каҷи обшавии муқаррарӣ (қуллаи ягона бо тақвияти ғайримуқаррарӣ)

Каҷи обшавии мушкилот (қурбшавии ғайримуқаррарии қуллаҳои бардурӯғ)
【Таҳлили парванда】

Як қуллаи асосӣ вуҷуд дорад, аммо dimer ибтидоӣ ҷиддӣ аст
Курчи як-қуллаи гудохта дар рақами зер метавонад чашмонатонро фиреб диҳад, фикр кунед, ки ин таҷрибаи комил аст, аммо натиҷа комилан нодуруст аст.Дар айни замон, мо бояд ба ҳарорати обтаъминкунӣ нигоҳ кунем.Ҳарорати қулл аз 80 ° C аст, ки комилан priver-dever аст.

Сурати зер аксест, ки бо телефони мобилӣ гирифта шудааст, ки аз ҷониби як аблаҳ ба ман фиристода шудааст.Мавҷакҳое, ки ӯ истифода бурд, ҳама брендҳои маъмулан дар соҳа истифода мешаванд.Вай аз як бренди префикси T ба бренди дигари Т-префикси иваз шуд.Scumbag ба ман фарёд зад: "Режент дар тасвири аввал истифода мешавад, ва қуллаи ягона аст.Баъдтар, пас аз истифодаи режент шумо тавсия медиҳед, он ба тасвири дуюм монанд мешавад, бо қуллаҳои омехта."
Ду графикро ҷудо кунед.Дар назари аввал, як қуллаи ягона дорад ва дигаре як чизи дукарата дорад.Оё ин дуруст аст?
Бадтар аз ду баробар e, агар ман ду расмро дар расм дар поён гузоштам, шумо фавран хоҳед фаҳмид.Дар асл, мо ба осонӣ бо ин гуна расм фалаҷ кардаем.Пас аз таҳлили бодиққат мо фаҳмидем, ки қуллаи тасвири аввал 75 ° C мебошад, ки он комилан Infer аст;Қуллаи тасвири дуюм 75 ° C ва 82 ° C пайдо мешавад, ҳадди аққал маҳсулот пайдо мешавад.

Аз ин рӯ, мушкилоти асосӣ на мушкилоти реактивҳо, балки мушкилоти тарҳрезии ибтидоӣ мебошад.Ҳамзамон, он инчунин исбот мекунад, ки баъзе брендҳои калон сифати оҳан надоранд ва он инчунин исбот мекунад, ки бародари ман пешин гуфт: ин бренди реаксия нест, ки мақолаи шуморо дастгирӣ намекунад.Маҳз мақолаи шумо бренди реактивҳоро дастгирӣ кард.Тасаввур кунед, ки агар харом реактивхоро иваз накунад, ба журнал маълумотхои нодуруст фиристода мешуданд ва ходисае, ки ба амал меояд, фочиа мегардид.

Фаҳмонед, ки агар назорати холӣ арзиши Ct дошта бошад, оё ин ифлосшавӣ нест?Аммо, шумо ба ҳар ҳол бояд фаҳмед, ки кадом назорати холӣ арзиши Ct дорад.Агар он NTC бошад, ин маънои онро дорад, ки ДНК-и хориҷӣ вуҷуд дорад, ба монанди ифлосшавии реактив.Агар он NRT бошад, ин маънои онро дорад, ки РНК-и истихроҷшуда ифлосшавии ДНК дорад.
3. Каҷи стандартӣ
Аз он ҷумла формулаи нишебӣ ва ҳисобкунӣ, самаранокии PCR-ро тавассути формула ҳисоб кардан мумкин аст.Таҷрибаи комил талаб мекунад, ки нишебии каҷи стандартӣ ба 3,32 ва R² ба 0,9999 наздик шавад.
4. Диапазони динамикии хатӣ
Диапазони динамикии реаксия хатӣ аст.Мувофиқи қолаби барои тавлиди каҷ, диапазони динамикӣ бояд ҳадди аққал 5 грейсари консентратсияро дар бар гирад ва ба тағир додани арзишҳои CT ва градиентҳои консентратсионӣ диққат диҳед.
5. Дақиқии ошкор
Тағирот дар натиҷаҳои QPCR, яъне сатҳи камбизоат, яъне дақиқии бад, аз ҷониби омилҳои зиёде, аз ҷумла ҳарорат, консентратсия ва амалиёт ба амал меояд.Дақиқии qPCR одатан бо кам шудани шумораи нусхабардорӣ камтар идорашаванда мегардад.Идеалӣ дар дохили тағири таҷрибавӣ, ин варианти техникӣ бояд аз вариантҳои биологӣ фарқ кунад ва нусхаҳои биологӣ мустақиман дар натиҷаи гурӯҳҳо ё табобат фарқиятҳои оморӣ ба фарқиятҳои оморӣ равона карда шаванд.Махсусан барои таҳлилҳои ташхисӣ, беҳтарин дақиқии байни таҳлилҳо (такрорпазирӣ) дар байни сайтҳо ва операторҳо бояд гузориш дода шавад.
6. Самаранокии ошкор ва LOD (дар AfdX QPCR)
LOD консентратсияи пасттарини 95% намунаҳои мусбати ошкоршуда мебошад.Ба ибораи дигар, консентратсияи LOD, ки дар маҷмӯи репликаҳои генҳои мақсаднок мавҷуд аст, набояд аз 5% реаксияҳои ноком зиёд бошад.Ҳангоми таҳлили Aftx CPPCR, хусусан барои ошкор кардани мутаносибии сершумори мултипликатсия, сершумори мултиплексҳо, муайян кардани миқдори сершумор ва самаранокии детри муҷаррад осеб надидаанд.Хусусан вақте ки генҳои мақсадноки консентратсионӣ ва генҳои мақсадноки пасти консентратсионӣ ҳамзамон мебошанд, ин мушкил бояд диққат дода шавад.
Проблемаҳо ва роҳҳои ҳалли онҳоУмуман, мушкилоте, ки аксар вақт ҳангоми ислоҳи qPCR дучор мешаванд, ба ҷанбаҳои зерин тамаркуз мекунанд:
· тақвияти ғайримуқаррарӣ
Интихоботи сахти консентратсияи дастурҳо ва мушкилот бо нишондиҳандаҳо

·Сохтори дуюмдараҷа ба самаранокии амплификация таъсир мерасонад

Ба амал меояд, ба назар гирифта мешавад, ки тарҳи дастур мувофиқ набошад, аммо агар шумо дар он шитоб накунед, шумо метавонед усулҳои зеринро аввал санҷед (принсип низ замима карда мешавад):

· Ҳасо ва вақти тӯлонӣ - Кам кардани имконияти вомбаргҳои заифи гидропоген;


Вазъияти муқобил - самаранокии ғайрифаъол ва тадбирҳои пастсифат ва чораҳои мубориза бо самаранокии пасти оммавӣ баръакс мебошанд:
· Муддати гармкунӣ ва дарозшавиро дароз кунед;
·Тағйир додани PCR-и се марҳила ва паст кардани ҳарорати табобат;
· Баланд бардоштани консентратсияи ибтидоӣ;
Ps: Бисёре аз донишҷӯён дар солҳои 90-ум таваллуд шудан мехоҳанд Омилҳои таркибӣ.Барои ба осонӣ мушкилӣ, беақлҳо бояд ҷорӣ кардани ширкати реактитентентиро хонанд, то бубинад, ки оё омиле вуҷуд дорад, ки вомбаргҳои сусти гидрогениро дар бар мегирад.
Интихоби душвори консентратсияи дастурҳо ва мушкилот бо нишондиҳандаҳо
Усули 1
Усули 2Тасвири зер натиҷаҳои миқдории миқдории миқёси васеътар нишон дода шудааст (100NM, 250000 - 250NM, 500NM) ва чор градиентҳои консентратсияи заминавӣ (0.1нг, 1NG, 10н, 10н, 10ng).

Интихоби селексияи консентратсионии PraceRation ҳар як консентратсияи дастурҳоро ба хатсайр зикршуда

Интихоби консентратсияи дастурҳо возеҳ аст, муносибатҳои хаттии консентратсияи Primer 800NM беҳтар аст ва муносибати хатари консентратсияи Prore 500 миллиард нафар камбағал аст.Дар 100NM ва 250 адад, арзиши 250нм нисбатан хурд аст, аз ин рӯ консентратсияи оптималии Prival 250н.Умуман дар хати гудохта дар хати гудохта дидан мумкин аст.Чӣ мешавад, агар дастурҳои тарроҳӣ наметавонанд пешгирӣ кунанд?
Усули 3
санҷиши градиентӣ.Барои амволи як қисмати муайяни қитъаҳо, ҳашт арволҳои ҳароратро муқаррар кунед, ки ҳар се такрорӣ ва каҷшудаи амлиёт чунин аст:

Интихоби ҳарорати гармкунӣ:
·70°C, 69°C — Аслан, праймерҳоро муттаҳид кардан мумкин нест, аз ин рӯ, тақвият дода намешавад.

·64,5°C——Қимати Ct паст мешавад.
·Дар 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C ва 55,0°C, арзишҳои Ct асосан устувор буданд, аммо арзишҳои флуорессенси ниҳоии гуногун буданд.
Чӣ тавр интихоб кардан?Принсип: Принсипи аввал арзиши олии CT мебошад.Барои ҳамин арзиши CT ҳарорати солонаи ҳароратро интихоб кунед, то ҳарорати пасттар ва ғайримуқаррарӣ набошад.Гарчанде ки арзиши баландтари flororescescence дар 55 ° C вуҷуд дорад, метавонад дар он гурӯҳ ё пуркунии он бошад.
Аммо агар шумо мисли шумо интеллектуалӣ бошед, шумо аниқ мепурсед, ки агар муносибати манфӣ бошад, агар тамоюли баландтарин бошад, нуқтаҳои паст бояд ба монанди рангҳои флюорессия ва DNTPS таъсир намерасонад.Дар ҳақиқат, то он даме, ки ҳарорати саноатӣ ба таври лозима оптимизатсия карда мешавад, таъсири консентратсияи Play аз арзиши CT табиатан кам карда мешавад.

Сохтори дуюм ба самаранокии амволӣ таъсир мерасонад

Сохтори дуюмдараҷа пайдо мешавад
Мумкин аст, ки баробари паст шудани градиенти њарорат мањсулот пайдо шуда, ќимати Ст пеш рафта, ба ќимати минимум дар 60,7°С мерасад ва пас аз паст шудани градиенти њарорат ќимати Ct калон мешавад.Он гоҳ баръало, зеро ҳарорат меафзояд, сохтори дуюмро меафзояд ва сатҳи амбастӣ меафзояд.Пас аз расидан ба ҳарорати муайян, баланд бардоштани ҳарорат самаранокии амволиро беҳтар карда наметавонад.Зеро дар ин вақт дастурҳо наметавонанд дар якҷоягӣ якҷоя карда шаванд.Бинобар ин,Ҳароратро бо арзиши пасттарини CT ҷустуҷӯ кунед, ки ҳарорат барои фароҳам овардани қолаби сохтори дуюм аст!Албатта, ҷоҳилони оқил бояд бидонанд, ки агар зарур бошад, беҳтар аст, ки дастур тағир додани дастурҳоро тағир диҳед ва аз минтақаи дуюмро пешгирӣ кунед.
5. Сатҳи барнома
MIQE - Таҳлили маълумот

Таҳлили маълумот асосан аз ҷониби асбоби фленесунментҳо дода мешавад.Дар мақолаи қаблӣ корҳои зиёде таҳлили таҳлили маълумот иҷро карда шуданд, масалан назорати холӣ, ки дар тарроҳии таҷриба шарҳ дода шудааст.Гузаронидани ишғолҳои дохилӣ, рақамҳои такрорӣ ва ғайра равшан карда шуданд.Дар ин ҷо мо истифодаи QPCR-ро мефаҳмонем.
QPCR ба таври васеъ истифода бурда мешавад ва ташхиси таҷрибавӣ ва ташхиси тотивии сенарияҳои маъмултарин мебошанд.
миқдори мутлақ
Журнал (тамаркузи ибтидоӣ) бо шумораи давраҳо муносибати хатӣ дорад.Як хати стандартӣ метавонад аз як стандарт бо рақами аввалини номатлуб иборат бошад, яъне муносибатҳои хаттии аксуламали амиқиро гирифтан мумкин аст.Мувофиқи арзиши Ct намуна, консентратсияи намуна метавонад ҳисоб карда шавад.Миқдори қолабҳо ба дохил шудан.

Усули ҳисобкунии миқдори мутлақ
Миқдори мутлақ бояд ба каҷи стандартӣ асос ёбад.Барои сохтани хатти стандартӣ стандарт лозим аст.Одатан, стандарт плазмидест, ки тавассути клон кардани гени мақсаднок ба даст оварда мешавад.Чаро он плазмид аст?Зеро ДНК-и плазмидии даврашакл устувортарин аст.Ҳангоми таносуби дуввум (нерӯи 10-оҳиста) маҳсулоти стандартиро дар 5 то 6 (6 сония), ҳангоми таҳқир кардан ба якрангӣ диққат диҳед.Бигзор арзиши Ct дар байни 15-30 афтад.

Омодасозии стандартӣ
Ҳамзамон, намунае, ки санҷида мешавад, бояд мутобиқи (Омили бодиққатро дар хотир дошта бошед ва арзиши CT низ бояд байни 15-30 коҳиш ёбад.Маҳсулоти стандартӣ + намунае, ки санҷида мешавад, дар мошин якҷоя гузошта мешавад.Пас аз давидан, хатти стандартӣ бо моддаҳои стандартӣ сохта шуда буд ва намунаҳо озмуда мешаванд, то консентратсияро ҳисоб кунанд.

Ҳисоб кардани рақами нусхабардорӣ
Консентратсияи намунае, ки бояд санҷида шавад (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × омили ҳалкунанда
Вазни молекулавии намуна = шумораи асосҳо × 324
Рақами намунавии санҷиш (нусха / UL)

Усули ҳисобкунии рақами нусхабардории рақам

Дар боло усули ҳисобкунӣ барои муайян кардани миқдор аст.Ин як мушкилоти математикӣ аст, ки пас аз хатми мактаб аз мактаби миёна ва мушкилоти математикӣ одатан бо компютер ҳал карда мешаванд.Агар шумо нафаҳмед, шумо метавонед барои муошират биёед.
миќдори нисбї
Миқдори нисбӣ асосан дар тадқиқоти илмӣ истифода мешавад.Чӣ қадар вирусҳо дар хун ҳастанд ва ин як вируси ДНК аст, ин як рӯйдоди нисбатан муайян аст: миқдори хун метавонад муайян карда шавад ва вируси DNA нисбатан мӯътадил бошад.Бо вуҷуди ин, барои мо муқоиса кардани шумораи нусхаҳои транскрипсияи як гени муайян дар барг душвор аст, зеро муайян кардани андоза, вазн ва нозукии барг душвор аст, муайян кардани миқдори РНК-и истихроҷшуда душвор аст ва муайян кардани самаранокии транскрипсияи баръакс низ душвор аст , яъне ҳар як қадам метавонад маълумоти таҷрибавӣ дошта бошад ва онро истифода набаранд.
Аз ин рӯ, миқдори нисбӣ бояд як унсурро ҷорӣ кунад:зуҳуроти дохилии дохилӣ.
Ба ибораи дигар, миқдорбандии нисбӣ воқеан муқоисаи гени мақсаднок ва гени истинодҳои дохилӣ мебошад.Дар муқоиса дар як бофта ва як ҳуҷайра, таъсири андозаи намуна, миқдори истихроҷи РНК, самаранокии транскрипсияи баръакс ва самаранокии PCR нисбатан хурд аст.Аз сабаби андозаи хурди намуна, ҳам генҳои истинодҳои дохилӣ ва ҳам генҳои мақсаднок нисбатан кам карда шуданд.Аз ин чост, ки мо пеш аз ин ба якдилй ва устувориро таъкид мекардем.
Ақлҳои истинодҳои дохилӣ одатан мебошандгенҳои хонагӣ(генҳои хонасоз), ки ба як синфи генҳо дахл доранд, ки дар ҳама ҳуҷайраҳо устуворанд ва маҳсулоти онҳо барои нигоҳ доштани фаъолияти асосии ҳаёти ҳуҷайраҳо заруранд.
Ин консепсияро омехта накунед.Генҳои хонагӣ истилоҳҳои функсияи биологӣ мебошанд, дар ҳоле ки генҳои истинодҳои дохилӣ истилоҳҳои техникии таҷрибавӣ мебошанд.Генҳои хонагӣ бояд пеш аз он ки онҳо ҳамчун генҳои истинодҳои дохилӣ интихоб шаванд, бояд аз санҷиш гузаранд.
Масалан, мо дар расми зер якчанд генҳои хоҷагидориро интихоб кардем, то сатҳи ифодаи онҳо дар ҳуҷайраҳои бофтаи гуногунро санҷем ва дарёфтем, ки сатҳи ифодаи β-2-микроглобулин аз генҳои дигар ба куллӣ фарқ мекунад, аз ин рӯ онҳоро ҳамчун генҳои истинод дар дохили истифода бурдан мумкин нест.

Пас аз фаҳмидани вазифаи ислоҳкунии гени истинодҳои дохилӣ, ду алгоритм аз ҳисоби ҷорӣ кардани гени истинодҳои дохилӣ ба даст оварда мешавад.
· усули каҷи стандартии дукарата
·2 – △△Усули Ct (усули муқоисаи арзиши CT)
Агар шумо ба омӯзиши намудҳо ва функсияҳои ген таваҷҷӯҳ дошта бошед, лутфан аз таҳқиқоти алгоритмҳо даст кашед ва формулаҳоро мустақиман истифода баред ё бевосита мошинҳоро истифода баред;Агар шумо як бача дар математика ва муҳандисӣ, лутфан худро озод ҳис кунед.
усули каљ стандарти дукарата
Миқдори гени мақсаднок ва гени хонагии намунаи назоратӣ ва намунае, ки тавассути хатти стандартӣ санҷида мешавад, муайян кунед ва сипас арзиши нисбии мувофиқи формулаи ҳисобкуниро ҳисоб кунед, ки сатҳи ифодаи нисбӣ мебошад.
Афзалиятҳо: Таҳлили оддӣ, беҳсозии нисбатан таҷрибавӣ
Камбудӣ: Барои ҳар як ген, ҳар як даври таҷрибаҳо бояд хатти стандартӣ созад
Ариза: Яке аз ду аз ҳама бештар усулҳои ҳамаҷонибаи миқдор дар омӯзиши Ибораи генофӣ эътирофшуда
Формула чунин аст:

Мисолҳо чунинанд:

Маблағи нисбиро дар асоси натиҷаи миқдорӣ ҳисоб кунед
2 - △△ усули CT (усули муқоисаи CT)

Афзалиятҳо: Барои сохтани каҷи стандартӣ лозим нест
Камбудиҳо: тахмин мезанад, ки самаранокии амбастагӣ то 100% зиёд аст;Даіиши стандартӣ <5% ва kurve-и стандартӣ ва самаранокии ҳар як амбияҳо муттасил мебошанд;Беҳтар кардани шароити таҷрибавӣ мушкилтар аст.
Ариза: Яке аз ду аз ҳама бештар усулҳои ҳамаҷонибаи миқдор дар омӯзиши Ибораи генофӣ эътирофшуда

Албатта, самаранокии амплификация одатан комилан ғайриимкон аст 1. Усули ислоҳ: Агар мо донем, ки гени мақсаднок ва гени истинод самаранокии якхела доранд, аммо самаранокии пурқувваткунӣ ба 1 баробар нест, пас 2－△△Ct-ро метавон чунин ислоҳ кард: (1+E )－△△Агар формулаи ampl5 дуруст бошад, масалан, самаранокии Ct. ба 1.95－△△Ct
То кунун, мундариҷа дар бораи PCR фленяддиҳанда ба охир расид.